總黃酮醇苷檢測條件的研究

晉 靜

（山西千匯藥業(yè)有限公司，山西 太原 030032）

1 儀器和試劑

（1）儀器：LC-10AT高效液相色譜儀。

（2）試劑：槲皮素、山柰素、異鼠李素對照品（均為中國藥品生物制品檢定所提供）；銀杏酮酯滴丸（山西千匯藥業(yè)有限公司，批號 090301，080401，080701）；甲醇、乙腈為色譜純；水為自制超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱 luna 5u C18（2）100A（200 mm×4.60 mm，5micron）；流動相：水（0.5%冰醋酸-0.1%三乙胺）：乙腈=70∶30；檢測波長368 nm；流量 0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 uL。理論塔板數(shù)按槲皮素計應不低于2 500；山柰素與異鼠李素峰分離度應大于1.5。

2.2 供試品溶液及對照品溶液的制備

取本品50丸，精密稱定，研細。精密稱定約相當于總黃酮醇苷19.2 mg的該粉末，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理（50 W，50 kHz，起始浴溫 25℃）20 min，放冷，再稱定重量。用甲醇補足缺失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10mL，置100mL錐形瓶中，加甲醇10 mL，25%鹽酸溶液5 mL，搖勻，置水浴中加熱回流30 min，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取濾液即得。另分別稱取經(jīng)P2O2二燥過夜的槲皮素、山柰素、異鼠李素對照品，置同一100 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.3 空白干擾試驗

空白干擾試驗，取相應的輔料適量，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液，分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各20 uL，按上述色譜條件測定，見圖1，按藥典標準，見圖2。結(jié)果：樣品中槲皮素、山奈素、異鼠李素與其他組分離較好且陰性對照在相應的位置無干擾。

2.4 標準曲線的制備

精密稱取槲皮素對照品10.36 mg，山奈素對照品10.74 mg，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密稱取異鼠李素對照品12.73 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取 0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件測定，分別進樣20 uL，測得峰面積積分值。以對照品的濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，槲皮素在4.144～41.44范圍內(nèi)呈良好線性關系，回歸方程：Y=54.09X-31.23；山奈素在4.296～42.96范圍內(nèi)呈良好線性關系，回歸方程：Y=57.41X-15.64；異鼠李素濃度在2.546～25.46范圍內(nèi)呈良好線性關系，回歸方程：Y=59.75X-26.38。

圖1 空白干擾本試驗對照

圖2 藥典用流動相對照

2.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，按上述色譜條件，每隔一段時間進樣1次，測得其峰面積積分值，見圖3，按藥典標準，見圖4。結(jié)果表明，供試品溶液24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，數(shù)據(jù)見表1。

圖3 穩(wěn)定性試驗樣品

圖4 藥典用流動相樣品

表1 供試品溶液24 h數(shù)據(jù)

2.6 精密度試驗

精密吸取對照品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進樣5次，測得峰面積積分值，見表2。

2.7 重復性試驗

取同一批號（080401）供試品，按供試品溶液制備方法平行制5份，按上述色譜條件測得其含量分別為:1.44mg/丸，1.43mg/丸，1.40 mg/丸，1.42 mg/丸，1.36 mg/丸；RSD值為 2.24%。

表2 連續(xù)進樣5次

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：080401，含量：1.44 mg/丸）適量，精密加入槲皮素、山奈素、異鼠李素混合對照品溶20 mL（濃度分別為：54.5 ug/mL、27.8 ug/mL、20.4 ug/mL），依法操作，按總黃酮醇苷含量=（槲皮素含量+山奈素含量+異鼠李素含量）×2.51計算，見表3。

表3 回收率試驗

3 結(jié)論

本實驗條件與用甲醇：0.4%磷酸溶液（50∶50）作流動相的比較，不僅峰形較好，而且樣品圖譜中槲皮素、山柰素之間的小峰與主峰的分離度也較好。