大鼠全腦照射后早期海馬水通道蛋白4 mRNA水平的變化

丁維軍，梁曉東，于長輝，朱敏

（臺州醫(yī)院 放療科，浙江 臺州 317000）

水通道蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的一組與水通透性有關(guān)的細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白，影響水跨膜轉(zhuǎn)運和細胞內(nèi)外環(huán)境平衡調(diào)節(jié)，在腦組織中主要為水通道蛋白4（AQP4），參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中腦水腫的形成[1]。急性期腦放射損傷表現(xiàn)為頭痛、昏睡、嘔吐等癥狀，一般認為其與腦水腫和血腦屏障破壞有關(guān)[2]。筆者在成功建立放射性腦損傷模型基礎(chǔ)上，觀察早期放射性腦損傷大鼠海馬區(qū)AQP4 mRNA表達的變化，探討AQP4在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 雌性SD大鼠分組與全腦照射 健康雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠36只，體質(zhì)量180～220 g，平均（200±10）g，由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供（SCXK浙2008-0033）。隨機分為20 Gy單次全腦照射后1 d、1周、2周、4周和8周及對照6個組別，每組各6只。X線照射方法[3]：大鼠經(jīng)3.6%水合氯醛麻醉（1 mL/100 g腹腔注射）后，俯臥于西門子加速器床板（西門子KD2型），應(yīng)用加速器產(chǎn)生的6MV-X線（劑量率200～210 cGy/min），源皮距SSD 100 cm，單次全腦照射，照射野3 cm×2 cm，光野上界位于雙眼后眥連線，下界位于雙耳后連線，左右露空。用1 cm厚的組織補償物覆蓋照射野。鉛塊屏蔽雙眼、頸部、胸腹部，參考深度為1.5 cm，照射總劑量20 Gy。

1.2 標本制作及海馬區(qū)AQP4 mRNA測定 大鼠全腦照射后1 d、1周、2周、4周和8周，大鼠3.6%水合氯醛麻醉（1 mL/100 g腹腔注射）后開胸，0.9%氯化鈉溶液250 mL灌注后，取海馬區(qū)腦組織液氮速凍研磨成粉后，Trizol抽提總RNA。RT-PCR檢測AQP4 mRNA的表達：提取的總RNA，加入隨機引物及M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA鏈。取cDNA 0.1μg，加入10×Buffer 2.5μL，25 mmol/L MgCl21μL，10 mmol/L dNTP0.5μL，20 pmol/μL的上下游引物各0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，滅菌雙蒸水將反應(yīng)體系補足至25μL。Thermo PX2型PCR儀進行擴增，以β-actin作為內(nèi)參照。AQP4反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 2 min；94 ℃變性45 s，61 ℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)。引物序列：AQP4引物:上游引物5’-TCCTCTACCTGGTCACACCC-3’，下游引物5’-GTCTTCTGTCTCCACTTGGCT-3’，擴增片段長458 bp。最后延伸10 min。擴增產(chǎn)物行1.7%瓊脂糖凝膠電泳，于BIO-RAD Gel 2000凝膠成像儀上成像，Quantity One軟件作半定量分析。

1.3 腦含水量測定 于各時間點在各組大鼠海馬區(qū)取厚度大約相同的腦組織，放在電子天平稱重，然后用鋁箔包裹放入恒溫電烤箱中100 ℃烘烤＞24 h，電子天平稱腦組織干重，按Elliot公式計算腦組織含水量[4]。腦組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對資料進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠海馬區(qū)腦組織AQP4 mRNA的表達 圖1示各組大鼠不同時間點海馬區(qū)AQP4 mRNA的表達水平，與對照組比較，大鼠20 Gy全腦照射后1 d下降，照射后1周達最低點（P＜0.01），2周時仍低于對照（P＜0.01），4周時高于對照組（P＜0.01），8周時仍高于對照組（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠海馬區(qū)腦含水量的比較 各組大鼠不同時間點海馬區(qū)含水量，與對照組比較，大鼠20 Gy全腦照射后1 d無明顯變化，照射后1周增加（P＜0.05），2周明顯增加（P＜0.01），4周時達高峰（P＜0.01），8周時仍明顯高于對照組（P＜0.01），具體見表1。

圖1 大鼠海馬區(qū)腦組織AQP4 mRNA的表達

表1 各組大鼠不同時間點海馬區(qū)腦含水量（n=6±s）

表1 各組大鼠不同時間點海馬區(qū)腦含水量（n=6±s）

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別 AQP4 mRNA 腦含水量（%）對照組 4.69±0.32 77.62±1.41 1d 4.24±0.39 78.99±1.34 1周 3.04±0.50b 79.64±0.90a 2周 3.71±0.32b 81.24±0.67b 4周 5.55±0.33b 83.96±0.81b 8周 5.45±0.27a 82.48±0.68b

2.3 各組大鼠腦含水量與AQP4 mRNA表達的相關(guān)性各組大鼠不同時間點腦含水量與AQP4 mRNA表達呈正相關(guān)（r=0.435，P＜0.01）。

3 討論

水通道蛋白是一組對水有高度選擇性的細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白。腦組織中的水通道蛋白主要是AQP4，主要分布于毛細血管周圍星形膠質(zhì)細胞和腦室室管膜細胞，海馬、視上核、室旁核和下丘腦等核團內(nèi)也有分布，促進細胞間、血管與腦室間水分子運動。有研究結(jié)果表明，AQP4的誘導(dǎo)表達與血腦屏障的破壞有關(guān)[5]。AQP4在缺血性腦卒中、全腦缺血后腦水腫中具有重要作用[6]。創(chuàng)傷性皮層損傷腦出血模型大鼠AQP4 mRNA在損傷位點的表達明顯增高，且同期MRI檢查顯示AQP4表達水平與水腫程度明顯相關(guān)[7]。而在敲除AQP4的轉(zhuǎn)基因小鼠腦缺血卒中模型中，則具有減輕腦水腫作用[8]。而在低O2高CO2小鼠腦損傷模型早期，小鼠腦組織AQP4表達明顯增高，腦細胞水腫[9]AQP4在腦水腫病理機制中的確切作用尚不明確，可能參與腦水腫的形成和消退。在6個月高血壓大鼠模型的額葉皮質(zhì)、紋狀體、海馬星形細胞足突AQP4表達上調(diào)，可能促使血腦屏障破壞，導(dǎo)致腦損傷[10]。缺血后早期AQP4可能通過移除組織中水分而限制腦水腫形成，而并不能阻止血腦屏障的破壞[11]。

本實驗結(jié)果顯示，大鼠20 Gy單次全腦照射后1 d、1周海馬區(qū)AQP4 mRNA表達下調(diào)，2周、4周和8周海馬區(qū)AQP4 mRNA上調(diào)，而此時海馬區(qū)表現(xiàn)為腦水腫。放射性腦損傷早期，由于血管內(nèi)皮細胞凋亡，內(nèi)皮細胞數(shù)量下降，血腦屏障破壞，水和大分子物質(zhì)進入細胞外間隙。腦照射后1個月，血管內(nèi)皮細胞增殖，血腦屏障通透性逐漸恢復(fù)。腦照射1個月后，血腦屏障再次破壞，導(dǎo)致腦組織乏氧和反應(yīng)性氧化物釋放。AQP4具有跨細胞膜雙向水流通調(diào)節(jié)功能，既可促進細胞內(nèi)水?dāng)z入，也可促進細胞外液水清除[12]。AQP4具有促進血管性腦水腫細胞外間隙內(nèi)水腫液清除的作用，提示大鼠腦照射后AQP4水平增強，可能是一種保護性反應(yīng)，以減輕腦水腫的形成。陳應(yīng)柱等[13]報道全腦照射后早期大鼠腦皮質(zhì)AQP4的蛋白表達下降，認為AQP4在腦水腫形成過程中表達增強或降低的時間取決于血腦屏障破壞的早晚。而本研究認為，放射性腦損傷時AQP4變化與血腦屏障間的關(guān)系尚需進一步研究。通過建立AQP4基因敲除大鼠放射性腦損傷模型，深入研究AQP4在放射性腦損傷發(fā)生發(fā)展中的病理生理作用，以便為放射性腦損傷提供新的治療策略。

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