單股正鏈RNA病毒基因組非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)與功能研究進展

哲名家，陳宗艷，李傳峰，劉光清

(中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

單股正鏈RNA病毒是一類成員眾多的病毒大家族，其成員可以感染幾乎所有的動物和植物，如由冠狀病毒引起的非典型性肺炎，由脊髓灰質(zhì)炎病毒導致的小兒麻痹癥，由丙型肝炎病毒（Hepatitis type C virus，HCV）引發(fā)的非A 非B病毒型肝炎，由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）造成的動物口蹄疫，由乙型腦炎病毒引發(fā)的人和動物的流行性腦炎等。由此可見，盡快找到治療、預防和控制RNA病毒性傳染病的藥物、疫苗或措施已成為國內(nèi)外科學家亟需解決的問題。要消滅病毒，首先要了解病毒，包括病毒的復制、表達和包裝等生命周期各個階段的特點。在漫長的生物演化過程中，為了節(jié)約有限的基因資源、進行高效的表達和復制，單股正鏈RNA病毒逐漸形成了一些可以自主調(diào)控病毒基因表達和復制功能的特殊性元件，即所謂的RNA順式作用元件（cis-acting RNA elements），包括保守的一級核苷酸序列和復雜的RNA高級結(jié)構(gòu)。大量研究資料表明，單股正鏈RNA病毒基因組末端的非編碼區(qū)（non-coding region，NCR）往往存在一些重要的順式調(diào)控元件，它們不僅參與RNA-RNA間相互作用，還可以通過與反式作用因子（transacting factor）結(jié)合，發(fā)揮對病毒基因組的復制、轉(zhuǎn)錄和組裝等過程的調(diào)控作用。本文就近年來一些關(guān)于單股正鏈RNA病毒基因組非編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)與功能研究進展情況進行綜述。

1 5'/3'NCR含有的特征性序列/結(jié)構(gòu)元件

1.1 莖環(huán)結(jié)構(gòu) 單股正鏈RNA病毒基因組5'/3'NCR內(nèi)部的核苷酸常發(fā)生回文現(xiàn)象，多呈發(fā)夾樣莖-環(huán)結(jié) 構(gòu)（stem-loop structure，SL）， 屬 于RNA二級結(jié)構(gòu)。其中，莖區(qū)（stem）是RNA分子內(nèi)部反向重復序列通過堿基配對形成的雙鏈區(qū)，而環(huán)區(qū)（loop）則是未配對的單鏈區(qū)。該結(jié)構(gòu)具有生物學功能，比如招募細胞因子，調(diào)控病毒復制和蛋白翻譯等過程。目前研究多集中在單鏈環(huán)區(qū)序列的特異性、雙鏈莖區(qū)的穩(wěn)定性以及莖環(huán)結(jié)構(gòu)的相對位置等。

1.2 核糖體內(nèi)部進入位點（internal ribosomal entry site，IRES） 已有兩種蛋白質(zhì)翻譯機制得到證實：一是真核生物多采取依賴于 RNA基因組5'端 m7 GpppN 帽子結(jié)構(gòu)的方式起始蛋白翻譯。二是某些病毒的RNA基因組雖然缺乏帽子結(jié)構(gòu)但卻以一種奇特的方式起始蛋白翻譯，例如腦心肌炎病 毒 (Encephalomyocarditis virus，EMCV) 5' NCR無帽子結(jié)構(gòu)卻擁有一段約534個核苷酸組成的一組RNA序列元件，它可以獨立招募核糖體起始蛋白的翻譯，正是憑借這一特殊元件，該病毒才能夠介導核糖體使之進入 mRNA內(nèi)彼此結(jié)合，起始病毒蛋白質(zhì)的翻譯。因此，這種只對于自身基因組起作用的稱為順式（cis）的RNA作用元件被稱為內(nèi)部核糖體進入位點（internal ribosome entry site,IRES）[1]。

依據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能，可將IRES歸為四種類型：Ⅰ型多見于腸道病毒屬(Enterovirus)和鼻病毒屬(Rhinovirus)，以脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus，PV）為典型代表；Ⅱ型多見于心病毒屬(Cardiovirus)和口瘡病毒屬(Aphthovirus)，以EMCV 為典型代表；Ⅲ型僅見于肝病毒屬(Hepatovirus)的甲型肝炎病毒(Hapatitis A virus,HAV )；Ⅳ類型多見于丙型肝炎病毒屬(Hepacivirus) 和瘟病毒屬(Pestivirus)，分別以丙型肝炎病毒(Hapatitis C virus，HCV )和豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)為代表[2]（圖 1）

圖 1 內(nèi)部核糖體進入位點四種類型Fig.1 Four types of internal ribosome-entry site (IRES) elements

在HCV的5' NCR中，含有IRES元件的Ⅱa區(qū)能為頂端區(qū)域與核糖體亞基互相作用提供合適的作用平臺。同樣含有IRES的Ⅲ區(qū)和Ⅳ區(qū)為細胞翻譯起始因子（eukaryotic initiation factors，eIFs）與核糖體亞基的結(jié)合提供了作用平臺[3]。Ⅰ-Ⅲ型IRES元件包含有一段富含嘧啶堿基序列（Yn），后面緊隨約15～20個左右的核苷酸（Xm） 及 AUG，并且高度保守[4]。研究表明，完整基序?qū)τ贗RES發(fā)揮功能至關(guān)重要。據(jù)推測，YnXmAUG 基序可能充當小核糖體亞基的附著位點，與腸病毒屬和EMCV不同的是存在于心病毒屬的泰勒病毒中的YnXmAUG基序在進行體外翻譯以及病毒復制都是不可或缺的[5]。1.3 假節(jié)結(jié)構(gòu)（pseudoknot ，Pk） 自 1982年在黃蘿卜花葉病病毒中發(fā)現(xiàn)以來，假節(jié)結(jié)構(gòu)才得到足夠認識，其本質(zhì)是由不同莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈環(huán)之間發(fā)生互補配對而構(gòu)成的三級結(jié)構(gòu)。例如，在博卡病毒（Kobuvirus）、腸道病毒（Enterovirus）以及FMDV等基因組5'/3'兩端發(fā)現(xiàn)有一至數(shù)個假節(jié)結(jié)構(gòu)存在。有趣的是，相吻作用（kissing interaction）就屬于假節(jié)結(jié)構(gòu)中的典型代表。脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus, PV）的3' NCR中X和Y兩莖環(huán)的單鏈環(huán)區(qū)各有六個堿基發(fā)生互補關(guān)系存在相吻作用（圖2）[6]。但受條件所限，至今對于假節(jié)結(jié)構(gòu)的了解仍然不清楚，據(jù)推測這種特殊的RNA元件可能為翻譯起始因子和核糖體相互識別而提供了作用結(jié)合位點，也可能起到激活I(lǐng)RES活性最終達到影響病毒翻譯過程的目的[7]。

圖2 脊髓灰質(zhì)炎病毒（PV）的3'NCR中存在假節(jié)結(jié)構(gòu)Fig.2 The pseudoknot(Pk)in the 3'NCR of Poliovirus（PV）

2 5'NCR高級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

2.1 5' NCR對病毒基因組復制的調(diào)控 Witwer等[8]發(fā)現(xiàn)5'NCR 與單股正鏈RNA病毒的復制關(guān)系十分甚為密切。在腸道病毒5'NCR中存在著大量高度保守的RNA順式作用元件。其中一個非常明顯形似“四葉式苜蓿草樣莖環(huán)結(jié)構(gòu)（cloverleaf,CL）”，它內(nèi)部的信號元件相互重疊被視為具有調(diào)節(jié)功能的關(guān)鍵性開關(guān)作用，參與調(diào)控病毒蛋白翻譯以及RNA復制。例如，當宿主細胞蛋白PCBP2和病毒聚合酶前體蛋白3CDpro分別與四葉式苜蓿草樣莖環(huán)結(jié)構(gòu)（CL）的分支SL-B和SL-D相互作用[9]后所產(chǎn)生的結(jié)果迥然不同，前者能極大增強病毒蛋白翻譯的效率；而后者將抑制病毒蛋白的翻譯，同時促進負鏈RNA的合成。因此，Andrea等[10]推測這些存在于RNA元件內(nèi)的四葉式苜蓿草樣莖環(huán)結(jié)構(gòu)（CL）可能攜帶病毒翻譯和復制的信號，當它與細胞蛋白（PCBP2）等結(jié)合后，將以核糖核酸蛋白復合物（ribonucleoprotein，RNP）的形式來調(diào)控病毒蛋白翻譯和RNA復制。

此外，Herold和Andino[11]又提出了一種模型（圖3），即在合成負鏈RNA之前，脊髓灰質(zhì)炎病毒（PV）基因組5' /3'端可發(fā)生環(huán)化作用，其中poly(A)結(jié)合蛋白（poly(A) binding protein，PABP）發(fā)揮中間橋梁的作用，其他兩端分別與poly(A)尾和核糖核酸蛋白復合物(RNP)相連并產(chǎn)生相互作用。顯然，核糖核酸蛋白復合物(RNP)對于促進病毒復制和增殖來說都是必需的。

圖 3 脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組末端序列環(huán)化模型Fig.3 The model of Poliovirus（PV）genome circularizes in the 5'/3'NCR

FMDV基因組5' NCR頂端存在一個大的莖環(huán)結(jié)構(gòu)稱為S片段（S fragment），Serrano等[12]通過體外實驗已證實，該S片段與poly(A)尾在體外存在相互作用。因此推測該S片段可能在RNA復制中發(fā)揮一定作用。研究表明，丙型肝炎病毒（HCV）的IRES總共有3個區(qū)域（區(qū)域Ⅱ-Ⅳ）。Kim等[13]已證實丙型肝炎病毒（HCV）基因組前40個堿基（包括區(qū)域Ⅰ）和IRES中的區(qū)域Ⅱ?qū)τ诓《净蚪M復制都是必要的。而IRES另外兩個區(qū)域（區(qū)域Ⅲ和區(qū)域Ⅳ）雖不是復制所必需，但能輔助前兩個區(qū)域進行復制，影響到RNA復制的效率。Friebe等[14]通過研究發(fā)現(xiàn)，雖然丙型肝炎病毒（HCV）5' NCR的前125個堿基對于RNA復制很關(guān)鍵，但其5' NCR的完整性對于基因組RNA能否高效地進行復制來說極其重要。

2.2 5' NCR對病毒基因組轉(zhuǎn)錄的調(diào)控 馬動脈炎病毒（Equine arteritis virus，EAV）基因組RNA和亞基因組RNA的5'NCR中包括一個前導序列（leader）。EAV 5'末端313個堿基對于病毒翻譯、RNA復制和亞基因組的合成都是必需的[15]。在5'NCR中，RNA通過折疊形成高級結(jié)構(gòu)，其中包括五個莖環(huán)結(jié)構(gòu)（SL A-E）、一段富含嘧啶堿基片段，其后還有五個莖環(huán)結(jié)構(gòu)（SL F-J）[16]，它們分別位于基因組前導序列及部分ORF1a內(nèi)。莖環(huán)G在前導序列中，其上有保守性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（transcription-regulating sequence，TRS），另外在ORF1b下游也存在一個與之互補的TRS（“body”TRSs）。二者之間的相互作用對于亞基因組的合成十分必要[17]。

2.3 5'NCR對病毒基因組翻譯的調(diào)控 實驗證明，小RNA病毒科甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）5'NCR中存在一些類似口瘡病毒屬和心病毒屬的順式作用元件[18]，其中就包括核糖體內(nèi)部進入位點（IRES），它在病毒蛋白的翻譯起始過程中發(fā)揮重要作用。此外，還發(fā)現(xiàn)HAV 5'NCR與宿主細胞的三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）存在相互作用，參與調(diào)節(jié)蛋白的翻譯[19]。另據(jù)報道稱，病毒蛋白前體3ABC在體外能結(jié)合到5'NCR上[20]。在HCV靠近5' NCR的核心編碼區(qū)中存在兩個保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（SL-Ⅴ和SL-Ⅵ），二者可能通過降低5'NCR和核心編碼區(qū)之間的抑制作用來激活I(lǐng)RES元件的功能[21]。最近有研究表明，在SL-Ⅵ的5'端（428～442 nt）和5' NCR中的24～38 nt序列間存在相互作用，這對依賴IRES的翻譯機制十分重要[22]。

2.4 5' NCR參與的RNA-RNA/protein相互作用登革熱病毒（Dengue virus，DENV）5' NCR中存在一個大的莖環(huán)（SLA）,它的作用可能是促進負鏈RNA的合成[23]。位于SLA下游有一段富含U的保守序列，其作用是在轉(zhuǎn)染的細胞中調(diào)控RNA合成。另外，靠近起始密碼子處還有一個小發(fā)夾結(jié)構(gòu)（SLB），該作用元件又包括一個5'端上游AUG區(qū)域，它與3'UAR存在堿基互補關(guān)系。此外，在5'端編碼蛋白C的環(huán)化序列（5'CS）和3'莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的環(huán)化序列（3'CS）之間也具有互補堿基。這種發(fā)生在基因組兩末端的長距離相互作用和環(huán)化作用已得到證實，可見它們對于DENV的RNA復制有重要作用[24]。

3 3'NCR內(nèi)高級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

3.1 3' NCR對病毒基因組復制的調(diào)控 小RNA病毒科3'NCR內(nèi)存在一級和高級結(jié)構(gòu)， Rohll等[25]已發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV 3'NCR 的 74 個核苷酸缺失后導致病毒 RNA的復制效率降低，說明3'NCR 在病毒復制過程中具有重要作用，可能參與了正鏈與負鏈合成的起始。又如PV 3' NCR具有兩個莖環(huán)結(jié)構(gòu)（X和Y），研究發(fā)現(xiàn)X莖環(huán)與poly(A)尾之間存在堿基配對關(guān)系，因此推測PV 3'NCR與poly(A)尾一起共同構(gòu)成負鏈RNA合成的復制起始位點[26]。另據(jù)報道PV的3'NCR中X和Y兩莖環(huán)的單鏈環(huán)區(qū)各有六個堿基存在相吻作用(kissing interaction)[27]。Brown等[28]通過對PV3'NCR序列進行突變后證實，破壞此結(jié)構(gòu)后基因組和亞基因組RNA的復制水平將有所降低，但并不會影響到RNA的正常翻譯。

令人驚訝的是同屬的鼻病毒14（Rhinovirus 14）能夠替代PV的 3'NCR[29]，表明PV的3Dpol與自身基因組RNA之間在復制過程中不存在特殊依存關(guān)系。另據(jù)報道，即使刪除PV的3' NCR之后，也不會影響PV在Hela細胞中的生長，只是抑制了病毒負鏈RNA的合成[30]，提示PV的3' NCR可能有關(guān)鍵性的RNA順式作用元件，保證了起始負鏈RNA合成的精準性。

盡管PV和腸道病毒屬其他成員的poly(A)尾長約90 nt，但與之互補的poly(U)卻只有20 nt[31]，這與之前研究是相符的，即poly(A)尾中只有20個核苷酸對于PV的復制和與PABP結(jié)合才是必需的[32]。HCV的3'NCR內(nèi)含有三個區(qū)域，分別為可變區(qū)（VR）、poly(U/UC)和高度保守的3'X尾。其中3'X尾又包括三個莖環(huán)結(jié)構(gòu)SL1、SL2和SL3。Yi等[33]通過缺失突變HCV亞基因組RNA復制子N端，發(fā)現(xiàn)3'NCR大部分序列中（包括3' X尾及poly(U/UC)）含有參與RNA復制的重要調(diào)控元件。雖然3'NCR的其余序列對于復制并不是必需的，但它能夠增強RNA的復制水平。另有研究發(fā)現(xiàn)3'X尾和poly(U/UC)在病毒的感染性方面也發(fā)揮一定作用[34]。

研究表明，位于HCV基因組3' NCR上游具有RNA聚合酶活性的非結(jié)構(gòu)蛋白（NS5B）的C端編碼區(qū)內(nèi)存在一個高度保守的穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)SL-Ⅴ，對RNA復制十分重要[35]。研究發(fā)現(xiàn)，純化的NS5B能夠與SL-Ⅴ特異性結(jié)合[36]。You等[37]也認為，SL-Ⅴ作為RNA順式作用元件在HCV復制中發(fā)揮了重要作用，將SL-Ⅴ移到3'NCR中，結(jié)果導致病毒RNA的復制效率降低。此外，SL-Ⅴ頂端環(huán)與位于3'NCR 內(nèi)的SL-2上的環(huán)區(qū)還存在相吻作用[38]。正是這一假結(jié)結(jié)構(gòu)利用不同莖環(huán)間的堿基互補配對方式來達到修正病毒RNA復制的目的。還有研究認為，一或多個反式作用因子可與保守的X尾存在相互作用，這可能增強相吻作用[39]。Diviney等[40]推測，SL-Ⅴ中的環(huán)結(jié)構(gòu)與NS5B上游約200個核苷酸的未配對序列可能存在著長距離的相互作用。

黃病毒屬的3'NCR比較特殊，如DENV 3'NCR區(qū)域Ⅱ包括保守序列和兩個莖環(huán)結(jié)構(gòu)（A2和A3），在莖環(huán)上還存在一個形似啞鈴狀的保守序列元件[41]。若缺失A2或A3后會減弱病毒RNA的復制水平。最保守的區(qū)域III也含有一個穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（3' SL），該莖環(huán)結(jié)構(gòu)是RNA復制必需的[42]。在3'SL上游還有保守的環(huán)化序列（CS1或3'CS）。蜱 傳 腦 炎 病 毒（Tick-borne encephalitis virus，TBEV）基因組可分為可變區(qū)和3'末端核心元件區(qū)[43]。在距3'末端有90～100個堿基序列可形成一個高度保守的結(jié)構(gòu)元件，該結(jié)構(gòu)是所有黃病毒科的典型特征。最近發(fā)現(xiàn)，TBEV的環(huán)化序列（5'-CS-A和3'-CSA）與以蚊為傳播媒介的登革熱病毒的CS元件并無相關(guān)性，二者在基因組中位置不同[44]，如TBEV的5'-CS-A位于5'NCR內(nèi)AUG的上游，3'-CS-A則在3'SL的莖部；另一個不同點是TBEV的C蛋白編碼區(qū)不是RNA復制所必需的。

EAV基因組和亞基因組負鏈RNA合成都是在3'末端起始的。經(jīng)分析EAV 3'末端序列長200 nt，其中有兩個結(jié)構(gòu)域?qū)τ赗NA合成十分重要[45]。第1個結(jié)構(gòu)域在3' NCR上游（12 610～12 654 nt），內(nèi)有一個小莖環(huán)（SL Ⅳ）；第2個結(jié)構(gòu)域在3' NCR內(nèi)部（12 661～12 690 nt）并折疊成一個大莖環(huán)結(jié)構(gòu)（SLⅤ）。

PRRSV的ORF7位于3' NCR上游并含有一段34 nt的序列，是負鏈RNA合成必需的[46]。該序列高度保守并能形成一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在莖環(huán)的環(huán)結(jié)構(gòu)上有一段7 nt長的序列能與3' NCR中的一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生相吻作用，對于病毒復制是必需的。

杯狀病毒3' NCR長短不一。鼠諾如病毒（Murine norovirus，MNV）3' NCR中擁有保守的次級結(jié)構(gòu)，類似的情況也出現(xiàn)在人類諾如病毒、水泡疹病毒和札幌病毒中。在MNV的3' NCR中有兩個大莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中一個末端發(fā)夾從7330 nt到末尾，另一個在7329 nt附近。通過對末端莖環(huán)突變后分析，發(fā)現(xiàn)這對RNA復制十分重要[47]。在FCV基因組3'末端也存在莖環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)位于3'NCR中并且靠近ORF3[48]。宿主細胞蛋白La、PTB和PAB均能與諾如病毒3'NCR-poly(A)中的順式作用元件結(jié)合，但相應的生物學功能目前不明確。

3.2 3'NCR對病毒基因組翻譯的調(diào)控 對于小RNA病毒， PABP在poly(A)的協(xié)助下通過結(jié)合IRES元件，從而達到增強翻譯起始效率的目的[49]。PABP 的完整性和 poly(A)尾結(jié)構(gòu)狀態(tài)對于翻譯的影響并不大[50]。研究發(fā)現(xiàn)，PV 3' NCR 能夠激發(fā)IRES的活性，這樣可以長時間維持病毒 RNA 5'NCR與 3'NCR末端的相互作用，從而使病毒在宿主細胞內(nèi)具有持久的活性[51]。

3.3 3' NCR參與的RNA-RNA/protein相互作用FMDV 3' NCR 能夠激發(fā) IRES的活性，但是這種激發(fā)作用與病毒基因組 3'末端 poly（A）尾的結(jié)構(gòu)及病毒蛋白酶（Lb）無任何關(guān)聯(lián)[52]。也許是由于病毒基因組5'和 3'末端之間形成了穩(wěn)定的 RNARNA 環(huán)化作用引起的，也有可能是病毒RNAProtein相互作用引起的，或者兼而有之。

最近有研究表明，F(xiàn)MDV的3'NCR中的每個莖環(huán)都能在體外與5'NCR的S片段相互作用，并且這種相互作用必須依賴于poly（A）尾存在的前提下才能起作用[53]。HAV 3' NCR中有一個假結(jié)體結(jié)構(gòu)。GAPDH不僅能夠與5' NCR相互作用，還能結(jié)合到3' NCR和基因組編碼區(qū)3Dpol基因序列的上游[54]。EAV兩種細胞蛋白（PTB和醛縮酶）能特異性的與3'NCR相互作用，但這種作用的生物學意義還不清楚。

4 結(jié)語

近年來，國內(nèi)外學者對單股正鏈RNA病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能進行了大量的研究，不僅有助于我們對此類病毒生命活動的了解，而且揭示了一些重要病毒的蛋白翻譯、RNA復制以及病毒包裝等過程的特征。如單股正鏈RNA病毒基因組中富含的RNA順式作用元件，以及它們在病毒基因組復制以及增強病毒蛋白翻譯起始等復雜過程中的作用等。這些發(fā)現(xiàn)對于人們了解RNA病毒的致病機理，并研發(fā)新型抗病毒藥物或疫苗等都提供了重要理論依據(jù)。

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