兩株H9N2亞型豬流感病毒全基因進化分析

葛菲菲，劉 健，鞠厚斌，楊德全，周錦萍

（上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103）

豬流感（swine influenza，SI）是由豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）引起的一種重要的豬呼吸道疾病，在世界各地均有流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失[1]。SIV 屬正黏病毒科、A型流感病毒屬。中國1994年從廣東省分離到第一株H9N2亞型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV），此后，該亞型病毒在全國范圍內(nèi)廣泛流行。H9N2亞型AIV不僅可以感染禽，而且也可以感染豬和人。震驚世界的97香港流感事件的發(fā)生，使人們認識到AIV可以不經(jīng)過中間宿主的適應突破種間屏障而直接感染人，該事件中有18人感染H5N1亞型AIV，其中6人死亡[2]。H9N2流感病毒對人類的感染與H5N1亞型不同，H9N2亞型流感病毒比H5N1亞型流感病毒溫和，可以感染人但不致人死亡?，F(xiàn)已證明H9N2亞型AIV可以感染豬[3-6]，那么，它就有可能通過在豬這個中間宿主中的適應，產(chǎn)生適合在人體內(nèi)繁殖的流感病毒，或者在豬體內(nèi)與豬流感病毒和/或人流感病毒重組，產(chǎn)生可感染人的新的流感病毒，進而引起人類流感大流行。1931年Shope等[7]分離鑒定了第1株SIV。目前已發(fā)現(xiàn)H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、 H4N6、 H9N2 等 9種SIV亞型。SIV在豬群中的流行日趨嚴重，血清學和病毒學監(jiān)測顯示H1和H3亞型SIV在中國豬群中廣泛流行，并且H9N2亞型SIV在豬群與人群中的流行也呈上升趨勢[8,9]。豬既有禽流感病毒（Avain influenza virus，AIV）的表面受體，又有人流感病毒的表面受體[10]，是流感病毒的混合器，AIV和人流感病毒均可感染豬，所以豬在流感病毒的種間傳播方面有重要意義。SI不僅嚴重妨礙養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，同時也威脅著人類健康，具有重要的公共衛(wèi)生學意義。本研究對H9N2亞型豬流感病毒河南株（Swine/Henan/Y1/09）和上海株（Swine/Shanghai/Y1/09）進行了全基因序列分析，為進一步防制豬流感的流行提供分子流行病學資料。

1 材料與方法

1.1 病毒 Swine/Henan/Y1/09（H9N2）株簡稱SW/HN/Y1/09，2009年7月從上海一家屠宰場的豬群中分離到的，該豬群產(chǎn)地為河南；Swine/Shanghai/Y1/09（H9N2）株簡稱SW/SH/Y1/09，2009年12月從上海一家屠宰場的豬群中分離到的，該豬群產(chǎn)地為上海本地；兩株毒株均由本中心分離保存。

1.2 全基因測序 根據(jù)GenBank收錄的H9N2亞型流感病毒8個基因片段序列，分別設計擴增H9N2亞型8個基因片段的特異性引物。試劑盒提取病毒基因組RNA，具體步驟按照說明書進行。RT-PCR產(chǎn)物電泳經(jīng)凝膠回收后，按pMD 18-T載體說明書進行連接、轉(zhuǎn)化，用EcoR I和Hind III進行雙酶切鑒定，鑒定為陽性克隆后送英駿生物有限公司測序。

1.3 基因cDNA核苷酸序列及推導的氨基酸序列分析比較 借助DNA Star4.0分析軟件，通過Jotun Hein方法分析比較所得序列的同源性以及一些關(guān)鍵位點的變化情況。

1.4 繪制系統(tǒng)發(fā)育樹 借助MEGA3.1分析軟件，確定這兩個毒株8個基因片段的遺傳分類情況。

2 結(jié)果

2.1 HA基因和NA基因全序列同源性比較以及一些關(guān)鍵位點的分析 兩株豬流感病毒HA基因的同源性為96.6%，NA基因的同源性為98.6%。通過http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/分析表明，兩株毒株HA1分子上具有7個共同的潛在糖基化位 點， 分 別 為 11、64、123、200、280、287和295位，在HA2分子上存在2個潛在的糖基化位點，為474和533位。表1為這兩個毒株和已發(fā)表的8株H9N2亞型豬流感病毒HA裂解位點和受體結(jié)合位點處的特征性氨基酸分析[11]，HA裂解位點的序列表明均為非高致病性毒株。通過BLAST發(fā)現(xiàn)，Swine/Henan/Y1/09的HA基因片段與1999年分離的禽H9N2亞型流感病毒有較高的同源性，而NA基因片段與2009年分離的禽H9N2亞型流感病毒有較高的同源性。Swine/Shanghai/Y1/09的HA和NA基因片段均與2009年分離的禽H9N2亞型流感病毒有較高的同源性（表2）。

2.2 2株分離株的8個基因片段的遺傳發(fā)生關(guān)系 這兩個毒株的HA和NA基因均屬于Ck/Bei/1/94系，而內(nèi)部基因已發(fā)生重排。其基因片段組成與2008年上海地區(qū)分離的一株健康雞群中分離的H9N2亞型毒株（Ck/Shanghai/Y1/2008）8個基因片段均分別屬于同一個基因群（圖1），表明流感病毒具有跨種間傳播的生物學特征。

3 討論

豬在流感病毒的種間傳播過程中，扮演著中間宿主和多重宿主的角色，是人流感病毒與禽流感病毒發(fā)生基因重排和重組的重要場所，被認為是人流感病毒和禽流感病毒的混合器。在豬體內(nèi)可以同時潛伏多種亞型的人、禽、豬流感病毒，發(fā)生基因重排和重組，產(chǎn)生新的流行毒株，在人群或畜禽中流行，所以對豬流感病毒進行研究具有重要的公共衛(wèi)生學意義。本研究中兩株H9N2亞型SIV的HA基因氨基酸序列分析均無缺失現(xiàn)象，HA裂解位點處為PSRSSR/GL，與表1中其余參考毒株的HA裂解位點不同，這兩株H9N2亞型SIV HA裂解位點處均無多個連續(xù)的堿性氨基酸插入，具有典型的低致病性禽流感病毒的HA基因特征。HA氨基酸序列分析表明，這兩株毒株HA1分子上具有7個共同的潛在糖基化位點，分別為11、64、123、200、280、287和295位；在HA2分子上存在2個潛在的糖基化位點，為474和533位。表1中10株H9N2亞型SIV在HA基因的受體結(jié)合位點上存在著顯著的差異，所有毒株在183、227和228位受體結(jié)合位點上的氨基酸是N、Q和G；190位受體結(jié)合位點變化最大，可以是A、G、T或V；在受體結(jié)合位點的226位，我們的兩株分離株為L，保持著人流感病毒的特征[11]；其他毒株在226位為Q或M。本研究中河南株的HA和NA基因是由1999年H9N2亞型禽流感毒株以及2009年H9N2亞型禽流感毒株重組形成，上海株的HA和NA基因來源于2009年H9N2亞型禽流感毒株，這兩株毒株均為重組體，并與Ck/Shanghai/

Y1/2008有相同的起源。本研究為進一步了解中國禽源H9N2亞型SIV的遺傳演化規(guī)律提供了相關(guān)基礎(chǔ)材料。

表2 兩株H9N2亞型豬流感病毒 HA和NA基因片段與參考株最高同源性比較Table 2 Genetic homology of the two H9N2 Swine influenza viruses with related sequences available in GenBank

圖1 兩株H9N2亞型豬流感病毒（Swine/Henan/Y1/09和Swine/Shanghai /Y1/09）8個基因片段進化樹Fig.1 Phylogenetic trees of eight gene segments of two H9N2 subtype Swine influenza viruses（Swine/Henan/Y1/09 and Swine/Shanghai /Y1/09）

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