雞傳染性支氣管炎病毒上海株的分離與鑒定

朱英奇，李 露，王世傳，陳宗艷，李傳峰，劉光清

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南昌 330045；4.安徽省全椒縣畜牧獸醫(yī)局，全椒 239500)

雞傳染性支氣管炎( Avian infectious bronchitis,IB) 是由傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）引起的雞一種急性、高度接觸性傳染病。雞群感染IBV后，可以對(duì)呼吸道、泌尿生殖系統(tǒng)或消化系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p傷，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的威脅比較大[1]。雛雞主要表現(xiàn)為高發(fā)病率和死亡率，成年蛋雞和種雞的病死率雖然比較低，但是由于可發(fā)生產(chǎn)蛋顯著下降，產(chǎn)軟殼蛋、畸形蛋以及孵化率下降等，給養(yǎng)禽業(yè)造成的損失更大[2,3]。 因此，雞傳染性支氣管炎一直是養(yǎng)雞企業(yè)重點(diǎn)防范的重要疫病之一[4]。但是，由于IBV血清型眾多，不同血清型之間交叉保護(hù)效果差，基因組的不斷變異和重組情況也不斷出現(xiàn)，使得雞傳染性支氣管炎的防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻[5,6]。因此，當(dāng)疫情發(fā)生時(shí)，及時(shí)進(jìn)行病原分離和鑒定，對(duì)于正確防治雞傳染性支氣管炎具有重要的指導(dǎo)意義。2011年，上海市附近某規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)持續(xù)發(fā)生以呼吸障礙、產(chǎn)蛋下降和產(chǎn)畸形蛋為主要特征的疫病。我們通過(guò)臨床診斷、病毒分離和鑒定，確定該疫情是由傳染性支氣管炎病毒感染引起，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 雞胚及雛雞 9～11日齡SPF雞胚和1日齡雛雞購(gòu)自上海家禽育種有限公司；新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）Lasota 毒株為上海獸醫(yī)研究所禽病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 病毒的分離 無(wú)菌取具病雞肺和腎臟，將病料1:5加滅菌生理鹽水研磨成乳狀，反復(fù)凍融3 次，10 800×g，4℃離心30 min ，取上清，用0.22μm微孔濾膜除菌。經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，每胚接種0.2 mL，37℃孵育，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚。96 h后，無(wú)菌收集尿囊液再接種10日齡SPF雞胚，如此連傳3代。

1.3 雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測(cè)定 取30枚10日齡SPF雞胚，分6組，每組5枚雞胚。將病毒液稀釋成10-2～10-7倍，每個(gè)稀釋度接種5枚SPF雞胚，0.2 mL /枚。每天照蛋2次，觀察雞胚狀況并記錄死亡情況，死亡雞胚放4℃保藏。孵化至15日齡，無(wú)菌收集尿囊液。按Read-Muench方法計(jì)算EID50。

1.4 干擾NDV增殖試驗(yàn) 將10日齡SPF雞胚分為3組，每組10枚。第1組雞胚經(jīng)尿囊腔接種分離株第5代雞胚尿囊液毒（0.2 mL/胚），37℃孵化10 h 后，接種NDV Lasota株（0.2 mL/胚）；第2組與第1組同時(shí)接種NDV Lasota株（0.2 mL/胚）；第3組為生理鹽水對(duì)照組；繼續(xù)孵化48 h，無(wú)菌收集尿囊液，按常規(guī)方法測(cè)尿囊液的血凝效價(jià)。

1.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 用第5代SPF雞胚尿囊液毒以滴鼻途徑接種15日齡SPF雛雞10只，0.2 mL/只（EID50=10-5.3/0.2 mL），同時(shí)以10只同日齡雛雞注射滅菌生理鹽水，作為對(duì)照，連續(xù)觀察10 d，剖殺所有未死亡試驗(yàn)雞。

1.6 RT-PCR檢測(cè) 根據(jù)GenBank中發(fā)表的IBV核苷酸序列（NC_001451），設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，上游引物：5'-TGGATAGTGTGGGTTGCTG-3'，下游引物：5'-CCATCCTTA ATACCTTCCTC-3'，預(yù)期PCR產(chǎn)物為445 bp。

病毒RNA的抽提及cDNA第一鏈的合成按照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后于72℃延伸10 min。取5 μL PCR進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，最后PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離 對(duì)兩份來(lái)自不同雞舍的的病料進(jìn)行雞胚分離，結(jié)果表明病毒盲傳3代后出現(xiàn)死亡，主要集中在48～96 h，可見頭頸部、胸部、腿部等處出現(xiàn)點(diǎn)狀出血（圖1b-c），未死雞胚則出現(xiàn)典型變化，表現(xiàn)為胚體發(fā)育受到抑制，出現(xiàn)侏儒胚，胚體卷曲（圖1d），胚腹腔有明顯的尿酸鹽沉積等特征性病理變化。

圖1 SPF雞胚接種病毒后的特征性病變Fig.1 The gross lesion of SPF chicken embryos inoculated with the isolated virus

2.2 雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測(cè)定 將病毒液稀釋成102～107倍，每個(gè)稀釋度接種5枚SPF雞胚，0.2 mL/枚，37℃孵化5 d。按照Read-Muench方法計(jì)算該病毒的EID50的值為5×105.3。

2.3 NDV增殖干擾試驗(yàn) HA結(jié)果顯示，第1組雞胚尿囊液的平均血凝價(jià)為29，第2組雞胚尿囊液平均血凝效價(jià)為211，說(shuō)明分離毒株可以明顯影響NDV在雞胚中的復(fù)制，能使其血凝效價(jià)降低2個(gè)滴度，與以往報(bào)道的情況一致。

2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 用分離病毒的尿囊液接種15日齡SPF雞以后，d4感染雞開始出現(xiàn)咳嗽、精神沉郁、噴嚏，羽毛凌亂，兩翅下垂，拉白色水樣稀糞等癥狀。d5出現(xiàn)死亡，病死率20%。對(duì)病死雞進(jìn)行解剖，可見氣管內(nèi)有大量粘液，喉頭出血，腎臟腫大，呈典型的花斑腎，輸尿管和腎小管內(nèi)充滿尿酸鹽結(jié)晶等腎型傳染性支氣管炎的特征病理變化。而對(duì)照組則沒有明顯病理變化。

2.5 RT-PCR檢測(cè)及序列測(cè)定結(jié)果 分別取攻毒組死亡雞和對(duì)照組雞肺臟和腎臟勻漿，反復(fù)凍融3次后，組織液進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果在攻毒組雞肺臟和腎臟中擴(kuò)增出預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物（圖2）。

圖2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The detection results of RT-PCR

利用BLAST程序，將測(cè)得的序列進(jìn)行網(wǎng)上比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它與冠狀病毒科中的雞傳染性支氣管炎病毒具有較高的親緣關(guān)系。其核苷酸與CK/CH/LDL/05III、CK/CH/LHLJ/06II、CK/CH/LGD/96I、HZ等分離株的同源性最高，達(dá)99%；與CK/CH/SD09/001、GXNN6、CK/CH/LHLJ/99I、LX4等分離株的同源性稍低，為95%。

3 討論

雞傳染性支氣管炎是高度接觸性傳染病，該病自1937年被正式報(bào)道以來(lái)，世界各國(guó)已分離并鑒定出許多不同血清型的IBV，且每年都有新的血清型出現(xiàn)。由于雞傳染性支氣管炎的臨床癥狀復(fù)雜，病原血清型較多，且彼此之間的交叉保護(hù)率較低，給疫病防治帶來(lái)很大困難，致使IB疫情綿延不斷，一直得不到很好的控制。最近，上海市某養(yǎng)雞場(chǎng)不斷發(fā)生以產(chǎn)蛋下降和呼吸障礙為特征的疫情，給生產(chǎn)帶來(lái)較大損失。接到疫情報(bào)道后，我們實(shí)驗(yàn)室從臨床發(fā)病雞腎病料中分離到1株病毒，經(jīng)HA試驗(yàn)、電鏡觀察、理化特性測(cè)定、血清學(xué)鑒定和動(dòng)物回歸試驗(yàn)等多種試驗(yàn)方法檢測(cè)，確診為腎型雞傳染性支氣管炎病毒。用該分離株的第5代SPF雞胚尿囊液接種非免疫雞，可復(fù)制出與自然發(fā)病雞相同的臨床癥狀，尤其以腎臟腫大、呈花斑樣和輸尿管中有多量白色尿酸鹽沉積為明顯特征，表明此毒株具有很強(qiáng)的嗜腎性，與以往報(bào)道的腎型傳染性支氣管炎病毒嗜腎毒株特征一致[7]，證實(shí)本次分離的病原為傳染性支氣管炎病毒嗜腎毒株。

因IBV核蛋白（N）基因在各型毒株間相對(duì)保守，常作為PCR檢測(cè)的靶基因[8]，本試驗(yàn)即以參考毒株的N基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，并從疑似病料中擴(kuò)增出了預(yù)期大小的基因片段，經(jīng)序列測(cè)定，證實(shí)為傳染性支氣管炎的特異性核酸序列。將該分離株的N基因序列與GenBank中登錄的多株國(guó)內(nèi)外參考毒株進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與國(guó)內(nèi)流行毒株：CK/CH/LDL/05III、CK/CH/LHLJ/06II、CK/CH/LGD/96I、HZ等分離株的核苷酸同源性均比較高。鑒于N基因是比較保守的核蛋白基因，因此可以根據(jù)其序列對(duì)IBV進(jìn)行基因分型。探討IBV SH11株與參考毒株之間的遺傳演化關(guān)系、致病特性和抗原變異等方面的研究將是我們下一步的研究方向。

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