斑馬魚：構(gòu)建神經(jīng)退行性疾病模型的新型模式生物＊

許大平 張?jiān)谲?李銘源

（中藥質(zhì)量研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（澳門大學(xué)），澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院，澳門 999078）

神經(jīng)退行性疾病是指一類在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元進(jìn)行性喪失所導(dǎo)致的疾病狀態(tài)，主要包括阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病及肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥等。隨著人口老齡化的加劇，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率在逐年增高，也越來(lái)越受到社會(huì)的關(guān)注。而目前的神經(jīng)退行性疾病治療方法無(wú)論從數(shù)量還是療效上都十分有限，為神經(jīng)退行性疾病尋找合適的治療方法也變得更加迫切。目前的神經(jīng)退行性疾病動(dòng)物模型在預(yù)測(cè)治療有效性上仍有局限［1］，發(fā)展新的神經(jīng)退行性疾病動(dòng)物模型并利用之進(jìn)行有效藥物篩選成為一項(xiàng)很有意義的工作。

1 斑馬魚簡(jiǎn)介

斑馬魚是一種市面常見的觀賞魚類，其體型纖細(xì)，對(duì)食物和水質(zhì)要求不高。更重要的是斑馬魚繁殖能力強(qiáng)，雌魚每周可產(chǎn)卵一次，每次幾百枚。其卵子體外受精，體外發(fā)育，胚胎發(fā)育速度快，胚胎和幼魚身體透明，便于形態(tài)學(xué)觀察。作為一種脊椎動(dòng)物，斑馬魚與人類基因組同源性高（約87%），基因組信號(hào)調(diào)控也與人類有很高的相似性［2］，所以在發(fā)育科學(xué)中，斑馬魚作為主要模式生物已經(jīng)有幾十年的應(yīng)用歷史。

在人類疾病及治療方法的研究中，斑馬魚模型的起步較晚，但是發(fā)展很快。因?yàn)榘唏R魚幼魚體積?。ǔ錾?天約4 mm），能被放進(jìn)96孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使斑馬魚對(duì)化合物量的需求很小，并且能夠適應(yīng)10%Dimethyl sulfoxide（DMSO）濃度的生存環(huán)境。這些特性使得斑馬魚在高通量先導(dǎo)化合物篩選上具有很大優(yōu)勢(shì)［3］，能夠縮短藥物的體內(nèi)研究時(shí)間。在神經(jīng)方面，研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了斑馬魚在學(xué)習(xí)，睡眠，藥物成癮及其他神經(jīng)行為表型與人類相似，并且可以定量研究［4－7］。斑馬魚的整個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，包括膽堿能，多巴胺能和去甲腎上腺素能通路已經(jīng)被闡明［8－9］。相比于其他無(wú)脊柱模式生物，斑馬魚出生后三天就開始發(fā)育功能完好的血腦屏障［10］。這些都說(shuō)明了斑馬魚模型在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究上的優(yōu)勢(shì)。另外，斑馬魚的諸多特性使其在分子生物學(xué)操作上具有很大的靈活性，利用反義嗎啉代寡核苷酸法（Morpholino oligonucleotides）在胚胎發(fā)育早期對(duì)斑馬魚進(jìn)行特定基因的暫時(shí)性沉默已經(jīng)成為應(yīng)用廣泛的研究方法。在構(gòu)建穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因品系方面，利用化學(xué)誘變，鋅指核酸酶或定向誘導(dǎo)基因組局部突變（Targeting induced local lesions in genomes，TILLING），能夠穩(wěn)定的敲除特定基因。mRNA注射或插入順式調(diào)控元件等可以在斑馬魚基因組中插入致病突變。本文主要圍繞斑馬魚構(gòu)建的神經(jīng)退行性疾病模型，介紹其在神經(jīng)退行性疾病相關(guān)領(lǐng)域近幾年的發(fā)展。

2 斑馬魚神經(jīng)退行性研究及疾病模型

2.1 阿爾茨海默病

阿爾茨海默病（Alzheimer′s Disease，AD）是發(fā)病率最高的神經(jīng)退行性疾病，其在65－69歲人群中發(fā)病率為1.53%，而在80－85歲人群中的發(fā)病率高達(dá)30%［11］。病人腦部病理學(xué)特征為細(xì)胞外淀粉多肽沉積形成腦部斑塊，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)伴有進(jìn)行性神經(jīng)元減少［12］。病人表現(xiàn)為認(rèn)知功能與記憶逐漸減退和行為錯(cuò)亂，從而嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。阿爾茨海默病是癡呆發(fā)生的最主要原因，50%以上的癡呆都與阿爾茨海默病有關(guān)。隨著人口老齡化的增加，阿爾茨海默病是一個(gè)必須面對(duì)的嚴(yán)峻問(wèn)題。阿爾茨海默病的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚無(wú)完全明確。關(guān)于其發(fā)病機(jī)制的主要假說(shuō)有β－淀粉樣蛋白毒性學(xué)說(shuō)，微管相關(guān)蛋白tau異常學(xué)假說(shuō)。

已知的一些與AD發(fā)病相關(guān)的基因，在斑馬魚上都有發(fā)現(xiàn)。在家族性早發(fā)型常染色體顯性遺傳阿爾茨海默病例中，其發(fā)病被認(rèn)為與編碼β淀粉樣前體蛋白（β－amyloid procursor protein，APP）和早老素（Presenilin，PSEN1and 2）的基因突變有關(guān)［13］。而載脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）和Sorting protein－related receptor containing LDLR class A repeats（SORL1）的基因變異也會(huì)導(dǎo)致個(gè)體患遲發(fā)型阿爾茨海默病風(fēng)險(xiǎn)增加。研究人員已在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)編碼APP的同源基因（appa，appb），與人類的同源性約70%［14］。編碼早老素的同源基因psen1和psen2也在斑馬魚上有發(fā)現(xiàn)［15－17］。而與AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的ApoE和SORL1在斑馬魚生同樣發(fā)現(xiàn)了同源基因。這些研究證明了斑馬魚作為AD研究模型的可能性。

β－淀粉樣蛋白（β－amyloid，Aβ）的形成是由于β－淀粉蛋白前體（APP）的非正常剪切和錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致的。Aβ在腦中堆積產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，被認(rèn)為是AD發(fā)病的病因之一。在斑馬魚中，發(fā)現(xiàn)了人APP的同源基因appa和appb［14］，以及與APP非正常剪切相關(guān)的β－內(nèi)分泌酶和γ－內(nèi)分泌酶同源基因［15，17］。但是斑馬魚體內(nèi)內(nèi)源性Aβ尚未被發(fā)現(xiàn)，從而也無(wú)從知道斑馬魚體內(nèi)APP的處理過(guò)程與人類的相似性。研究者們對(duì)在斑馬魚中建立Aβ毒性模型進(jìn)行了諸多嘗試。在2009年第六屆歐洲斑馬魚發(fā)育與遺傳學(xué)會(huì)議上，有研究者報(bào)導(dǎo)嘗試通過(guò)插入人突變基因APPswe建立斑馬魚Aβ模型，但是并未顯示出明顯病理特征。Newman［18］等最近也嘗試構(gòu)建一種新的表達(dá)Aβ淀粉樣蛋白同時(shí)又更易于觀察的斑馬魚AD模型用于高通量篩選。他們嘗試讓Aβ42淀粉樣蛋白特異性表達(dá)在斑馬魚黑色素細(xì)胞中。但是這種轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚直到長(zhǎng)成16個(gè)月的成魚才表現(xiàn)出明顯的色素異常，失去了早期高通量篩選的價(jià)值。

tau蛋白是一種磷酸蛋白，具有促進(jìn)神經(jīng)元合成和穩(wěn)定神經(jīng)元的作用。研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦中的tau蛋白發(fā)生了過(guò)度磷酸化，引起微管蛋白組裝紊亂，從而導(dǎo)致神經(jīng)元骨架變質(zhì)和神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)（Neurofibrillarytangles，NTFs）。Tau在AD發(fā)病中的重要意義，吸引了研究者們構(gòu)建斑馬魚tau模型的興趣。Chen［19］等發(fā)現(xiàn)了編碼微管相關(guān)蛋白tau在斑馬魚體內(nèi)的同源基因mapta和maptb。Tomasiewicz等［20］將綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的人類tau蛋白用顯微注射的方法打入1－2細(xì)胞期的斑馬魚胚胎中，注射后48 h即可觀察到蛋白的纏結(jié)，并最終在斑馬魚體內(nèi)形成于AD病人相似的神經(jīng)纖維纏結(jié)，從而構(gòu)建出一種斑馬魚的AD模型。Bai等［21］構(gòu)建了利用斑馬魚enolase－2啟動(dòng)子表達(dá)GFP或人突變4－repeat tau，構(gòu)建了穩(wěn)定遺傳的Tg（eno2：GFP）和Tg（eno2：Tau）品系。在Tg（eno2：Tau）品系中，tau在斑馬魚整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)都有表達(dá)并在視網(wǎng)膜，脊髓，軸突和神經(jīng)元胞體沉積并形成神經(jīng)纖維纏結(jié)。eno2啟動(dòng)子在斑馬魚24－72days postfertilization（dpf）期間表達(dá)逐步增加，并可穩(wěn)定表達(dá)至其成年。因此，此研究同時(shí)提供了一個(gè)理想的調(diào)控元件來(lái)構(gòu)建更多神經(jīng)退行性疾病模型。Paquet［22］也構(gòu)建了一種穩(wěn)定遺傳的tau蛋白病變的斑馬魚轉(zhuǎn)基因模型：其利用Gal4／UAS表達(dá)系統(tǒng)為構(gòu)建出了熒光蛋白標(biāo)記的人tau蛋白，并在斑馬魚中迅速重現(xiàn)了與人類似的過(guò)磷酸化，神經(jīng)纖維纏結(jié)等病理特征和神經(jīng)功能與行為學(xué)異常等表征。值得一提的是，利用此模型Paraquat等篩選出了一種tau激酶GSK3β抑制劑，提示此模型在藥物初期篩選中具有很大潛力。Van Bebber［23］等利用這種tau蛋白病變的斑馬魚模型檢測(cè)了已進(jìn)入臨床二期實(shí)驗(yàn)的能延緩AD病人認(rèn)知功能減退藥物亞甲基藍(lán)對(duì)tau蛋白毒性的保護(hù)作用，但是亞甲基藍(lán)沒有緩解此模型中的任何病理特征。

2.2 帕金森綜合癥

帕金森綜合癥（Parkinson’s disease，PD）是繼阿爾茨海默病之后第二大神經(jīng)退行性疾病，它一種影響運(yùn)動(dòng)功能的進(jìn)行性發(fā)展的疾病。一般認(rèn)為與黑質(zhì)－紋狀體的多巴胺能神經(jīng)通路被破壞有關(guān)，其主要病理學(xué)特點(diǎn)就是中腦黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元大量死亡和Lewy小體的形成。病人一般出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)緩慢，肌肉強(qiáng)直和震顫。與阿爾茨海默病相似，PD也是多因素誘發(fā)疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未明確。研究表明，PD的發(fā)病與 α－synuclein［24］，parkin［25］，UCH－L1［26］，DJ－1，PINK－1 和LRRK2等基因突變有關(guān)。

由異常的α－synuclein蛋白聚集形成的Lewy小體是帕金森病的主要病理特征之一。但在斑馬魚中并未發(fā)現(xiàn)α－synuclein同源基因。但Prabhudesai等［27］構(gòu)建了過(guò)表達(dá)人α－synuclein基因的斑馬魚模型，并觀察到神經(jīng)元凋亡。他們利用這個(gè)模型驗(yàn)證了新型分子鑷CLR01在斑馬魚體內(nèi)能夠成功阻斷α－synuclein的聚集，顯著改善斑馬魚生存率。這個(gè)研究給斑馬魚模型用于抗PD藥物篩選提供了良好的例子。

DJ－1，parkin，PINK－1，LRRK2，uch－L1等在斑馬魚中都可以找到相應(yīng)的同源基因，其中，DJ－1同源性為89%［28］，parkin同源性為75%［29］，PINK－1為62%［30］，LRRK－2同源性為71%［31］，UCH－L1為79%［32］。

在人早發(fā)型帕金森病中，編碼Parkin蛋白的PARK2基因是被發(fā)現(xiàn)突變概率最高的基因。斑馬魚同源基因park2所轉(zhuǎn)錄出的蛋白氨基酸序列與人類的有62%的同源性，在關(guān)鍵活性部位90%相同。Flinn等［29］利用morpholino對(duì)斑馬魚Parkin進(jìn)行敲減后，3dpf斑馬魚出現(xiàn)了間腦多巴胺能神經(jīng)元減少的現(xiàn)象，并且對(duì)神經(jīng)毒素MPTP的敏感性增加。這也是目前為止唯一一個(gè)發(fā)現(xiàn)與人類PARK2相關(guān)帕金森病有相同表型動(dòng)物模型，盡管現(xiàn)在還不知道斑馬魚中的多巴胺能神經(jīng)元減少時(shí)因?yàn)榘l(fā)育的推遲還是真正的神經(jīng)退行性變，但是這個(gè)模型仍然具有很重要的意義。人PARK2基因變異會(huì)造成線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的活性下降，而park2敲減的斑馬魚表現(xiàn)出了同樣表征。

在斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)中，park7表達(dá)的DJ－1遍布腦和脊髓［28］，Bretaud發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚中和哺乳動(dòng)物中，park7基因的功能具有非常強(qiáng)的保守性。Bretaud等用morpholino對(duì)park7進(jìn)行敲減之后，并沒有影響斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，但是增加了多巴胺能神經(jīng)元對(duì)氧化損傷的敏感性［33］。而park7敲減的斑馬魚經(jīng)蛋白酶體抑制劑MG132處理后，表現(xiàn)出經(jīng)Bax和P53介導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元凋亡。阻斷P53能夠有效抑制這種凋亡。此研究提示park7敲減的斑馬魚可能具有篩選神經(jīng)保護(hù)藥物的潛力。

Anichtchik等［30］對(duì)斑馬魚PINK1基因進(jìn)行了敲除，敲除后的魚出現(xiàn)間腦多巴胺能神經(jīng)元減少，同時(shí)也出現(xiàn)脊柱彎曲，尾部發(fā)育不正常等現(xiàn)象。同時(shí)，與人類的帕金森病理特點(diǎn)一樣，PINK1敲除的斑馬魚也產(chǎn)生了更多自由基。LRRK2是常染色體顯性遺傳PD中常見的變異基因。Sheng［34］等在對(duì)斑馬魚與人類LRRK2的同源基因zLRRK2進(jìn)行敲除的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，敲除整個(gè)zLRRK2基因會(huì)導(dǎo)致斑馬魚死亡，但是敲除zLRRK2的WD40區(qū)域卻可以造成斑馬魚的類帕金森病病理改變，如間腦多巴胺能神經(jīng)元減少和行為學(xué)異常。但是Ren等［35］最近的研究對(duì)此結(jié)果提出質(zhì)疑，認(rèn)為 WD40區(qū)域的敲除雖然消除了zLRRK2的表達(dá)，但是并沒有導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元減少。由此可見，LRRK2基因在斑馬魚帕金森模型上的應(yīng)用還需要更多研究。

神經(jīng)毒素是現(xiàn)今最常用的復(fù)制帕金森病動(dòng)物模型的經(jīng)典工具。常用的神經(jīng)毒素有1－甲基－1，4－苯基－1，2，3，6－四氫吡啶（1－methyl－4－phenyl－1，2，3，6－tetrahydropyridine，MPTP）以及6－羥基多巴胺。MPTP是一種能夠引起動(dòng)物類帕金森病癥狀和病理的神經(jīng)毒素。MPTP于20世紀(jì)80年代在美國(guó)偶然被發(fā)現(xiàn)在人身上有引起帕金森癥狀作用［36］，后來(lái)引入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，用于帕金森病的造模［37］。帕金森現(xiàn)行的治療藥物左旋多巴和司來(lái)吉蘭都可以改善MPTP誘導(dǎo)的帕金森癥狀。Lam［38］首先將MPTP應(yīng)用于斑馬魚幼魚并觀察到其多巴胺神經(jīng)元的顯著性減少，而其他神經(jīng)元不受影響。McKinley［39］等參照在哺乳動(dòng)物中的造模，將 MPTP應(yīng)用于斑馬魚幼魚中，他又用morphlino和特異性阻斷劑分別阻斷了神經(jīng)元細(xì)胞膜上的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（Dopamine transporter，DAT）和星型膠質(zhì)細(xì)胞中的單胺氧化酶－B，均起到了對(duì)MPTP毒性的保護(hù)作用，由此說(shuō)明在斑馬魚體內(nèi)MPTP作用機(jī)制與在人類和其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)大體相同，而不同于線蟲等無(wú)脊椎動(dòng)物。這項(xiàng)研究建立了斑馬魚帕金森病的高通量篩選模型。在McKinley之前，Bretaud等［40］在成年斑馬魚上測(cè)試MPTP毒性也取得了不錯(cuò)的結(jié)果，但是其研究側(cè)重點(diǎn)在于利用斑馬魚研究帕金森病的發(fā)病機(jī)理。6－OHDA也是一種與MPTP相似的能夠造成多巴胺神經(jīng)元損傷的神經(jīng)毒素［41］，但是其不能通過(guò)血腦屏障，所以一般采取微注射的方式進(jìn)行給藥。

在斑馬魚帕金森模型中觀察藥物的保護(hù)作用，除了觀察其行為學(xué)改變［42］外，更重要的是觀察間腦多巴胺神經(jīng)元是否減少。而現(xiàn)行的方法無(wú)論是原位雜交還是免疫染色操作都比較復(fù)雜。研究者一直致力于建立能夠直觀觀察多巴胺能神經(jīng)元的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系。已報(bào)道的幾個(gè)研究都嘗試?yán)枚喟桶飞锖铣赏緩街械幕騺?lái)建立在多巴胺能神經(jīng)元中特異性表達(dá)熒光蛋白的模型［43－46］，但是都不能達(dá)成理想的效果。

2.3 亨廷頓舞蹈癥

亨廷頓舞蹈癥（Huntington’s disease，HD）是一種單基因遺傳性神經(jīng)退行性疾病，主要病因是患者第四號(hào)染色體上的huntingtin（Htt）基因發(fā)生變異，產(chǎn)生了變異的蛋白質(zhì)（聚谷氨酰胺），該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)逐漸聚集，形成大的分子團(tuán)。一般患者在中年發(fā)病，逐漸喪失說(shuō)話、行動(dòng)、思考和吞咽的能力，病情大約會(huì)持續(xù)發(fā)展15年到20年直到最后死亡。目前HD并無(wú)特異有效治療方法，一些藥物可以延緩癥狀但是不能阻止疾病發(fā)展。

在斑馬魚中，Htt基因已經(jīng)被克隆，其表達(dá)的蛋白含有3121個(gè)氨基酸，與人類的同源蛋白有70%同源性［47］。用morpholino對(duì)斑馬魚Htt基因進(jìn)行敲除后可引發(fā)一系列發(fā)育變化包括頭眼變小，色素變淺等［48］。Schiffer等［49］將綠色熒光標(biāo)記的N端帶有不同長(zhǎng)度的聚谷氨酰胺（PolyQ）的Htt mRNA注射入斑馬魚胚胎內(nèi)，隨著PolyQ的增長(zhǎng)，胚胎發(fā)育中的異常和凋亡就更加明顯。這個(gè)研究也再次證明了Miller等［50］之前發(fā)現(xiàn)的polyQ 56或以上都可以在斑馬魚胚胎中產(chǎn)生包涵體并引起毒性作用。Schiffer等在斑馬魚身上應(yīng)用了Hsp40和Hsp70兩種在無(wú)脊椎HD模型中可以polyQ聚集的物質(zhì)，在斑馬魚上也取得了很好的效果。但是這兩種物質(zhì)卻不能阻止polyQ的毒性作用。最近，Williams等［51］建立了一種表達(dá) GFP－Huntington［71Q］的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，一些在哺乳動(dòng)物體內(nèi)阻止polyQ聚集的物質(zhì)在這個(gè)斑馬魚模型中也有同樣效果。因此，這個(gè)轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系以后可以被用來(lái)進(jìn)行治療HD藥物的先導(dǎo)化合物體內(nèi)篩選。

2.4 肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ALS）

Amyotrophic lateral sclerosis（ALS）是一種在脊髓，腦干和運(yùn)動(dòng)皮層中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元選擇性丟失的神經(jīng)退行性疾病。主要表現(xiàn)為肌無(wú)力肌萎縮。家族遺傳性ALS的發(fā)病與superoxidase dismutase 1（SOD1）基因的突變有關(guān)［52］。Lemmens等用注射mRNA的方法造成SOD在斑馬魚體內(nèi)的過(guò)表達(dá)突變。其結(jié)果是斑馬魚感覺神經(jīng)元無(wú)形體變化，但運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元出現(xiàn)變短和異常分枝等，與人類的ALS病理特點(diǎn)類似。這個(gè)模型可能對(duì)研究運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元對(duì)于SOD過(guò)表達(dá)的易感性有很大幫助。同時(shí)，Lemmens也發(fā)現(xiàn)，激發(fā)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）在斑馬魚體內(nèi)的過(guò)表達(dá)，會(huì)減少SOD過(guò)表達(dá)對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損害，反之則會(huì)加劇。這與哺乳動(dòng)物模型中的效果一樣。說(shuō)明斑馬魚ALS模型至少在一些生理過(guò)程方面與哺乳動(dòng)物模型是相同的。

3 總結(jié)與展望

斑馬魚因?yàn)槠潴w積小，成本低，繁殖速度快，易于觀察以及與人類相對(duì)高的同源性和眾多的轉(zhuǎn)基因品系，成為了藥物初步體內(nèi)篩選的上佳選擇。近年來(lái)在神經(jīng)退行性病變研究領(lǐng)域，斑馬魚的關(guān)注度越來(lái)越高。盡管與人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)有較大的區(qū)別，斑馬魚在基本的神經(jīng)傳導(dǎo)系統(tǒng)、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類型以及與疾病相關(guān)基因同源性上與人類都很相似?，F(xiàn)在，用化學(xué)物質(zhì)造模的神經(jīng)退行性變模型已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。對(duì)斑馬魚與人類疾病相關(guān)的基因同源性的研究也有助于對(duì)人類神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制的深入了解。越來(lái)越多的斑馬魚神經(jīng)退行性變轉(zhuǎn)基因品系正在問(wèn)世，為以后新的藥物和治療方法的研究提供了廣闊的空間。

1 Beal MF.Parkinson′s disease：a model dilemma［J］.Nature，2010，466（7310）：S8－10.

2 Postlethwait JH，Woods IG，Ngo－Hazelett P，et al.Zebrafish comparative genomics and the origins of vertebrate chromosomes［J］.Genome Res，2000，10（12）：1890－1902.

3 Grunwald DJ and Eisen JS.Headwaters of the zebrafish－emergence of a new model vertebrate［J］.Nat Rev Genet，2002，3（9）：717－724.

4 Cahill GM.Clock mechanisms in zebrafish［J］.Cell Tissue Res，2002，309（1）：27－34.

5 Guo S.Linking genes to brain，behavior and neurological diseases：what can we learn from zebrafish［J］Genes Brain Behav，2004，3（2）：63－74.

6 Ninkovic J and Bally－Cuif L.The zebrafish as a model system for assessing the reinforcing properties of drugs of abuse［J］.Methods，2006，39（3）：262－274.

7 Zhdanova IV，Wang SY，Leclair OU，et al.Melatonin promotes sleep－like state in zebrafish［J］.Brain Res，2001，903（1－2）：263－268.

8 Rink E and Wullimann MF.Connections of the ventral telencephalon（subpallium）in the zebrafish （Danio rerio）［J］.Brain Res，2004，1011（2）：206－220.

9 Wullimann MF and Mueller T.Teleostean and mammalian forebrains contrasted：Evidence from genes to behavior［J］.J Comp Neurol，2004，475（2）：143－162.

10 Jeong JY，Kwon HB，Ahn JC，et al.Functional and developmental analysis of the blood－brain barrier in zebrafish［J］.Brain Res Bull，2008，75（5）：619－628.

11 Vandenberghe R and Tournoy J.Cognitive aging and Alzheimer′s disease［J］.Postgrad Med J，2005，81（956）：343－352.

12 Selkoe DJ.The molecular pathology of Alzheimer′s disease［J］.Neuron，1991，6（4）：487－498.

13 Rademakers R and Rovelet－Lecrux A.Recent insights into the molecular genetics of dementia［J］.Trends Neurosci，2009，32（8）：451－461.

14 Musa A，Lehrach H and Russo VA.Distinct expression patterns of two zebrafish homologues of the human APP gene during embryonic development［J］.Dev Genes Evol，2001，211（11）：563－567.

15 Groth C，Nornes S，McCarty R，et al.Identification of a second presenilin gene in zebrafish with similarity to the human Alzheimer′s disease gene presenilin2［J］.Dev Genes Evol，2002，212（10）：486－490.

16 Nornes S，Newman M，Wells S，et al.Independent and cooperative action of Psen2with Psen1in zebrafish embryos［J］.Exp Cell Res，2009，315（16）：2791－2801.

17 Leimer U，Lun K，Romig H，et al.Zebrafish（Danio rerio）presenilin promotes aberrant amyloid beta－peptide production and requires a critical aspartate residue for its function in amyloidogenesis［J］.Biochemistry，1999，38（41）：13602－13609.

18 Newman M，Wilson L，Camp E，et al.A zebrafish melanophore model of amyloid beta toxicity［J］.Zebrafish，2010，7（2）：155－159.

19 Chen M，Martins RN，and Lardelli M.Complex splicing and neural expression of duplicated tau genes in zebrafish embryos［J］.J Alzheimers Dis，2009，18（2）：305－317.

20 Tomasiewicz HG，F(xiàn)laherty DB，Soria JP，et al.Transgenic zebrafish model of neurodegeneration［J］.J Neurosci Res，2002，70（6）：734－745.

21 Bai Q，Garver JA，Hukriede NA，et al.Generation of a transgenic zebrafish model of tauopathy using a novel promoter element derived from the zebrafish eno2gene［J］.Nucleic Acids Res，2007，35（19）：6501－6516.

22 Paquet D，Schmid B and Haass C.Transgenic zebrafish as a novel animal model to study tauopathies and other neurodegenerative disorders in vivo［J］.Neurodegener Dis，2010，7（1－3）：99－102.

23 van Bebber F，Paquet D，Hruscha A，et al.Methylene blue fails to inhibit tau and polyglutamine protein－dependent toxicity in zebrafish［J］.Neurobiol Dis，2010，39（3）：265－271.

24 Polymeropoulos MH，Higgins JJ，Golbe LI，et al.Mapping of a gene for Parkinson′s disease to chromosome 4q21－q23［J］.Science，1996，274（5290）：1197－1199.

25 Kitada T，Asakawa S，Hattori N，et al.Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism［J］.Nature，1998，392（6676）：605－608.

26 Leroy E.，Boyer R.，Auburger G.，et al.，The ubiquitin pathway in Parkinson′s disease［J］.Nature，1998，395（6701）：451－452.

27 Prabhudesai S，Sinha S，Attar A，et al.A Novel"Molecular Tweezer"inhibitor of alpha－Synuclein neurotoxicity in vitro and in vivo［J］.Neurotherapeutics，2012，9（2）：464－476.

28 Bai Q，Mullett SJ，Garver JA，et al.Zebrafish DJ－1is evolutionarily conserved and expressed in dopaminergic neurons［J］.Brain Res，2006，1113（1）：33－44.

29 Flinn L，Mortiboys H，Volkmann K，et al.Complex I deficiency and dopaminergic neuronal cell loss in parkin－deficient zebrafish（Danio rerio）［J］.Brain，2009，132（Pt 6）：1613－1623.

30 Anichtchik O，Diekmann H，F(xiàn)leming A，et al.Loss of PINK1 function affects development and results in neurodegeneration in zebrafish［J］.J Neurosci，2008，28（33）：8199－8207.

31 Sheng DL，Qu DB，Kwok KHH，et al.Deletion of the WD40Domain of LRRK2in zebrafish causes Parkinsonism－like loss of neurons and locomotive defect［J］.Plos Genetics，2010，6（4）：e1000914.

32 Son OL，Kim HT，Ji MH，et al.Cloning and expression analysis of a Parkinson′s disease gene，UCH－L1，and its promoter in zebrafish［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，312（3）：601－607.

33 Bretaud S，Allen C，Ingham PW，et al.p53－dependent neuronalcell death in a DJ－1－deficient zebrafish model of Parkinson′s disease［J］.J Neurochem，2007，100（6）：1626－1635.

34 Sheng D，Qu D，Kwok KH，et al.Deletion of the WD40domain of LRRK2in zebrafish causes Parkinsonism－like loss of neurons and locomotive defect［J］.PLoS Genet，2010，6（4）：e1000914.

35 Ren GQ，Xin SC，Li S，et al.Disruption of LRRK2does not cause specific loss of dopaminergic neurons in zebrafish［J］.PLoS One，2011，6（6）：e20630.

36 Langston JW，Ballard P，Tetrud JW，et al.Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine－analog synthesis［J］.Science，1983，219（4587）：979－980.

37 Smeyne RJ and Jackson－Lewis V.The MPTP model of Parkinson′s disease［J］.Brain Res Mol Brain Res，2005，134（1）：57－66.

38 Lam CS，Korzh V and Strahle U.Zebrafish embryos are susceptible to the dopaminergic neurotoxin MPTP［J］.Eur J Neurosci，2005，21（6）：1758－1762.

39 McKinley ET，Baranowski TC，Blavo DO，et al.Neuroprotection of MPTP－induced toxicity in zebrafish dopaminergic neurons［J］.Brain Res Mol Brain Res，2005，141（2）：128－137.

40 Bretaud S，Lee S and Guo S.Sensitivity of zebrafish to environmental toxins implicated in Parkinson′s disease［J］.Neurotoxicol Teratol，2004，26（6）：857－864.

41 Anichtchik OV，Kaslin J，Peitsaro N，et al.Neurochemical and behavioural changes in zebrafish Danio rerio after systemic administration of 6－h(huán)ydroxydopamine and 1－methyl－4－phenyl－1，2，3，6－tetrahydropyridine［J］.J Neurochem，2004，88（2）：443－453.

42 Flinn L，Bretaud S，Lo C，et al.Zebrafish as a new animal model for movement disorders［J］.J Neurochem，2008，106（5）：1991－1997.

43 Bai Q and Burton EA.Cis－acting elements responsible for dopaminergic neuron－specific expression of zebrafish slc6a3（dopamine trans－porter）in vivo are located remote from the transcriptional start site［J］.Neuroscience，2009，164（3）：1138－1151.

44 Gao Y，Li P and Li L.Transgenic zebrafish that express tyrosine hydroxylase promoter in inner retinal cells［J］.Dev Dyn，2005，233（3）：921－929.

45 Meng S，Ryu S，Zhao B，et al.Targeting retinal dopaminergic neurons in tyrosine hydroxylase－driven green fluorescent protein transgenic zebrafish［J］.Mol Vis，2008，14：2475－2483.

46 Wen L，Wei W，Gu W，et al.Visualization of monoaminergic neurons and neurotoxicity of MPTP in live transgenic zebrafish［J］.Dev Biol，2008，314（1）：84－92.

47 Karlovich CA，John RM，Ramirez L，et al.Characterization of the Huntington′s disease（HD）gene homologue in the zebrafish Danio rerio［J］.Gene，1998，217（1－2）：117－125.

48 Lumsden AL，Henshall TL，Dayan S，et al.Huntingtin－deficient zebrafish exhibit defects in iron utilization and development［J］.Hum Mol Genet，2007，16（16）：1905－1920.

49 Schiffer NW，Broadley SA，Hirschberger T，et al.Identification of anti－prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model［J］.J Biol Chem，2007，282（12）：9195－9203.

50 Miller VM，Nelson RF，Gouvion CM，et al.CHIP suppresses polyglutamine aggregation and toxicity in vitro and in vivo［J］.J Neurosci，2005，25（40）：9152－9161.

51 Williams A，Sarkar S，Cuddon P，et al.Novel targets for Huntington′s disease in an mTOR－independent autophagy pathway［J］.Nat Chem Biol，2008，4（5）：295－305.

52 Deng HX，Hentati A，Tainer JA，et al.Amyotrophic lateral sclerosis and structural defects in Cu，Zn superoxide dismutase［J］.Science，1993，261（5124）：1047－1051.