潔凈室微生物監(jiān)測培養(yǎng)基的選擇

柴海毅

（上海諾狄生物科技有限公司，上海 201612）

GB/T 16293-2010醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測試方法和GB/T 16294-2010醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法中微生物監(jiān)測的培養(yǎng)基采用的是大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）和沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA），而《中國藥典》2010年版微生物限度檢測選用的培養(yǎng)基分別是營養(yǎng)瓊脂（NA）和玫瑰紅鈉瓊脂（RBA）。作為微生物限度檢測的環(huán)境微生物監(jiān)測，如何來確定環(huán)境微生物監(jiān)測的培養(yǎng)基呢？

潔凈室微生物監(jiān)測方案的確定，實(shí)質(zhì)上就是培養(yǎng)基的選擇和培養(yǎng)條件的確定。用于環(huán)境微生物監(jiān)測的培養(yǎng)基首先必須具備的就是要有良好的廣譜性，即對目標(biāo)微生物的選擇性很低，可以滿足大多數(shù)需氧微生物的生長。大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）和沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA）作為微生物培養(yǎng)全能型培養(yǎng)基的杰出典范，早就已經(jīng)成為USP/EP中微生物限度檢驗(yàn)的細(xì)菌、真菌（包括：霉菌、酵母菌）的首選，也成為制藥潔凈環(huán)境微生物監(jiān)測中浮游菌或沉降菌監(jiān)測培養(yǎng)基的不二選擇。

微生物限度檢驗(yàn)培養(yǎng)基的確定國外藥典（包括：USP，EP和JP）是依據(jù)微生物自身營養(yǎng)條件確定的，而中國藥典則是按照微生物的類別確定的。這就形成了目前中國藥典與國外藥典在微生物限度檢驗(yàn)方面培養(yǎng)基的不同。隨著中國藥典微生物檢測中培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步提高和國產(chǎn)培養(yǎng)基行業(yè)的逐步規(guī)范，中國藥典定會收載大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）和沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA）作為微生物限度檢測培養(yǎng)基的主要種類，本文就以大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）和沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA）為主要培養(yǎng)基來設(shè)計(jì)潔凈環(huán)境監(jiān)測方案。

任何一個(gè)環(huán)境監(jiān)測方案都必須包括對空氣、表面和人員的監(jiān)測。下面就針對以上三個(gè)監(jiān)測對象的環(huán)境監(jiān)測方案中培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的確定分別討論。

1 空氣監(jiān)測

浮游菌或沉降菌作為空氣微生物監(jiān)測的主要方法，理想的培養(yǎng)基應(yīng)該是大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）和沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA）。

1.1 需氧微生物總數(shù)（TAMC）

培養(yǎng)后在TSA培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)有真菌生長，應(yīng)當(dāng)按需氧菌來計(jì)數(shù)。培養(yǎng)條件的確定：如果選是要計(jì)數(shù)需氧微生物總數(shù)，培養(yǎng)條件可以采用分別在20℃～25℃，30℃～35℃各培養(yǎng)3天，先高溫后低溫。如果是僅計(jì)數(shù)細(xì)菌總數(shù)，培養(yǎng)條件可以采用30℃～35℃培養(yǎng)5天[1]。

1.2 真菌總數(shù)（TYMC）

如果某產(chǎn)品本身對真菌（包括霉菌和酵母菌）有嚴(yán)格要求，或環(huán)境中真菌的生物負(fù)荷比較大，這時(shí)的環(huán)境微生物的監(jiān)測方案中就不能僅有TSA培養(yǎng)基一種了，還必須使用沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA）來監(jiān)測真菌。培養(yǎng)條件可以是20℃～25℃培養(yǎng)5天。同樣，如果培養(yǎng)后，在SDA培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長，應(yīng)當(dāng)按真菌來計(jì)數(shù)。在這里應(yīng)該注意一點(diǎn)的是，如果因?yàn)榧?xì)菌的生長，會使總真菌數(shù)或酵母菌總數(shù)超過了規(guī)定的限度，則應(yīng)該在沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA）中加入少量的抗生素抑制細(xì)菌的生長，通常是在配制沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA）時(shí)加入1%的氯霉素。

2 表面監(jiān)測

表面作為潔凈室的主要污染源之一，也是環(huán)境監(jiān)測的主要內(nèi)容。醫(yī)藥工業(yè)潔凈室內(nèi)不可避免會留有消毒劑的殘留，抗生素生產(chǎn)車間的抗生素殘留以及部分有抑菌作用藥物API的殘留，都會造成潔凈室表面微生物監(jiān)測結(jié)果的“假陰性”。GMP2010就明確指出如果被監(jiān)測環(huán)境中使用過消毒劑或有抗生素，則要向表面監(jiān)測用培養(yǎng)基中加一些添加劑[2]。如何有效的防止這種“假陰性”結(jié)果的出現(xiàn)，唯一有效的辦法就是在用于表面監(jiān)測的培養(yǎng)基中加入一些添加劑。在A級、B級這些潔凈等級較高的潔凈區(qū)浮游菌，沉降菌的取樣，還應(yīng)特別關(guān)注培養(yǎng)基平皿的無菌性。非最終滅菌的取樣平皿，會帶來監(jiān)測結(jié)果的“假陽性”。特別值得注意的是，為盡力避免監(jiān)測“假陽性”結(jié)果，國內(nèi)制藥企業(yè)多采用實(shí)驗(yàn)室配制平皿100%預(yù)培養(yǎng)后再取樣的步驟，預(yù)培養(yǎng)后的平皿如果沒有經(jīng)過促生產(chǎn)試驗(yàn)（Growth Promotion Test），又會產(chǎn)生另一種的“假陰性”的結(jié)果。

表面微生物監(jiān)測主要的取樣方法有接觸平皿法、擦拭法和表面沖洗法。三種方法各有優(yōu)劣，分別適用于不同的表面取樣，測試數(shù)據(jù)都能夠用來評估潔凈環(huán)境表面微生物的污染水平。

接觸取樣平皿（Replicate Organism Detection and Counting）作為快速取樣測試，而且可以定量監(jiān)測的表面微生物的方法，越來越被廣泛采用[3]。

表面微生物監(jiān)測培養(yǎng)基的選擇，潔凈環(huán)境中消毒劑殘留對微生物的影響是設(shè)計(jì)表面監(jiān)測方法不得不直面的問題。國外越來越多的制藥公司在表面微生物培養(yǎng)時(shí)，選擇的培養(yǎng)基是大豆酪蛋白+吐溫80+卵磷脂瓊脂培養(yǎng)基（即TSAWLP），吐溫80+卵磷脂中和劑可以降解掉表面可能殘留的季銨鹽類消毒劑（新潔爾滅等），因而添加有吐溫80+卵磷脂的TSA培養(yǎng)基可以方便地應(yīng)用在使用了季銨鹽類消毒劑的表面。采用大豆酪蛋白+吐溫80+卵磷脂瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件可以等同采用需氧微生物總數(shù)的培養(yǎng)條件。

3 人員監(jiān)測

人是潔凈環(huán)境中的最大污染源，生產(chǎn)操作人員衛(wèi)生的控制和監(jiān)測直接影響著潔凈室的環(huán)境等級。強(qiáng)調(diào)生產(chǎn)操作人員對潔凈環(huán)境的影響，首先是要嚴(yán)格規(guī)范潔凈區(qū)，尤其在A級，B級區(qū)操作人員的各種行為，因?yàn)闈崈魠^(qū)操作人員的行為是維持潔凈區(qū)平衡不可或缺的。

操作人員衛(wèi)生檢查基本與表面微生物監(jiān)測類似，培養(yǎng)基的選擇上可以忽略消毒劑等得影響，不必選用添加有中和劑的培養(yǎng)基，可以直接使用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）和沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA），但不可忽略抗菌素和API的影響。除此之外，完全可以等同采用空氣監(jiān)測的培養(yǎng)條件。

[1] European pharmacopoeia,7.0, Microbiological examination of nonsterile products: microbical ecumeration tests, 2010, 2-12.

[2] 國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品認(rèn)證管理中心. 藥品GMP指南（無菌藥品分冊）[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2011，353.

[3] 國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品認(rèn)證管理中心. 藥品GMP指南（無菌藥品分冊）[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2011,358.