人臍血間充質干細胞治療終末期肝病的進展

姚 勇綜述，曾維政，戴立里△審校

（1.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院消化內科 400010；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院消化內科，成都 610083）

目前我國的乙型肝炎病毒攜帶者超過l億，是終末期肝病患者的主要來源人群。終末期肝病患者常發(fā)生胃底－食管靜脈曲張破裂出血、肝性腦病等嚴重并發(fā)癥，每年死亡人數(shù)超過30萬，是嚴重影響健康的社會問題。同種異體肝移植被認為是治療終末期肝病的最佳手段，臨床肝移植術已經(jīng)成為一種公認的治療終末期肝病的常規(guī)手術，由于受到供體的限制、手術本身潛在風險以及移植后發(fā)生移植物抗宿主病，治療費用昂貴，其臨床應用受到很大限制，因此迫切需要一種替代療法或過渡療法。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有獨特的免疫調節(jié)作用、能自我更新、跨胚層多向分化的特點，近年來MSCs原位肝移植治療終末期肝病已成為國內外的研究熱點，移植手術風險較小、費用較低。但多數(shù)研究均以骨髓及脂肪，尤其骨髓來源的MSCs原位肝移植多見［1］，而臍血間充質干細胞（umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCBMSCs）原位肝移植的研究較少，現(xiàn)將UCB-MSCs向肝細胞誘導分化及治療終末期肝病的相關研究及進展綜述如下。

1 UCB-MSCs概述

MSCs來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，是干細胞家族的重要成員，可來自骨髓、臍帶血、脂肪組織以及胎兒肝臟、肺臟、血、骨髓等。UCB-MSCs具有和骨髓來源的 MSCs相似的形態(tài)、表型特征和多向分化潛能［2］，可合成多種生長因子和細胞因子，對肝臟內局部微環(huán)境產(chǎn)生營養(yǎng)性旁分泌作用［3］。UCB-MSCs在體內或體外，可分化為肝、骨、脂肪、肌肉、肌腱、韌帶、心肌、神經(jīng)等多種組織細胞，并且經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍然具有多向分化的潛能，可作為理想的種子細胞用于病變或衰老引起的組織器官損傷的修復［4］。任紅英等［5］研究證實UCB-MSCs在體外能分化為有功能的肝樣細胞，能以時間依賴方式產(chǎn)生清蛋白和分泌尿素，能夠抑制淋巴細胞增殖，具有低免疫原性的特征。

2 UCB-MSCs的采集、分離與培養(yǎng)

通常選擇健康足月順產(chǎn)或剖宮產(chǎn)的新生兒的臍血采集UCB-MSCs，臍血采集后需在6h內進行處理，切除雙側帶夾痕及瘀血的部分，可選擇植塊法、膠原酶消化法或膠原酶聯(lián)合胰酶消化法等獲取細胞，竇慧慧等［6］認為足月分娩、新鮮臍帶、采用組織塊平鋪法和MesencultTM培養(yǎng)基，對UCB-MSCs的采集、分離、培養(yǎng)成功率較高。UCB-MSCs的分離方法現(xiàn)在仍缺乏統(tǒng)一的方案，獲得較多數(shù)量且活性高的干細胞仍困難重重。目前采用的分離方法為：（1）密度梯度離心及貼壁細胞分離法［7］：根據(jù)細胞的密度差異從臍血中離心分離出單個核細胞后，利用UCB-MSCs具有貼壁生長的特性，用貼壁法將其分離。（2）免疫磁珠分離法：運用表面帶有特異抗體標記的免疫磁珠與干細胞相結合，通過永久磁鐵的磁性吸附出細胞。（3）流式細胞儀分離法［8］：流式細胞儀根據(jù)細胞表面的不同標記及大小的差異進行分離；（4）單細胞克隆法［9］。運用較多、較成熟的還是密度梯度離心、貼壁細胞分離法，該法雖然分離所得細胞純度不高，但簡單易行，成本較低，能較好地保持干細胞的活性。

3 UCB-MSCs的表面標記

UCB-MSCs是混合的細胞群體，既有間質細胞，又有上皮細胞和內皮細胞的特征，而無真正意義上的特異性標志。流式細胞學檢測發(fā)現(xiàn)，UCB-MSCs與骨髓間充質干細胞相似，不表達造血細胞標記CD45、CD34等，不表達主要組織相容性復合物Ⅱ類分子及人白細胞抗原識別有關的共刺激分子，也不表達內皮細胞標記（如vWF、KDR和CD31），但整合素和黏附分子CD95、CD90、CD105、CD44、CD73等的表達率可達 95% 以上［10］。研究認為其表面的標記基本可分為3類：（1）黏附分子：CD13、CD54、CD44、CD51等；（1）整合素家族：CD49b（＿2-integrin）、CD29（＿1-integrin）、CD49d（＿4-integrin）、CD51（＿vintegrin）；（3）其他：ASMA、CD90（Thy1）和 SH2（CD105）、HLA-ABG和 SH13（CD166，ALCAM）、SH4（CD73）等［7，11］。

4 UCB-MSCs向肝細胞的誘導分化

4.1 體外誘導分化為肝細胞的方法

UCB-MSCs具有多向分化的潛能，誘導UCB-MSCs向肝細胞分化的主要方法包括細胞因子誘導和理化損傷誘導。

4.1.1 細胞因子誘導 研究者運用較多的可誘導 UCBMSCs向肝細胞轉化的細胞因子主要包括促肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、致瘤因子 M（oncostatin M，OSM）和成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）等。由于UCB-MSCs比成體MSCs更加幼稚、原始，利用UCMSCs啟動肝細胞的發(fā)生信號及傳導系統(tǒng)，所需誘導因子的劑量和濃度都較骨髓等來源的MSCs高，方法大致分為以下幾種：（1）唐曉鵬等［12］利用 HGF誘導 UC-MSCs分化，成功地誘導了肝細胞的產(chǎn)生；（2）何念海等［13］將 UC-MSCs培養(yǎng)于1%基質膠包被并加有FGF-4的肝細胞生長培養(yǎng)基，不僅表達肝細胞標志，更具有與肝細胞合成代謝活性相一致的功能特征；（3）Chivu等［14］和 Yoon等［15］以 OSM 作 為誘導劑成 功 誘導UCB-MSCs轉化 為肝 細 胞；（4）熊 中 華 等［16］聯(lián) 合 HGF 和FGF4成功誘導 UC-MSCs定向分化為類肝細胞；（5）聯(lián)合HGF、FGF及OSM為誘導劑，高蕾等［17］采用階段誘導法，誘導UCB-MSCs向肝細胞轉化，結果在4周內觀察到了所誘導細胞形態(tài)的改變，運用RT-PCR檢測到在形態(tài)發(fā)生改變的細胞內存在甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）mRNA的表達。

4.1.2 理化損傷誘導 過去有研究證實，MSCs在受到理化損傷后可向肝細胞分化，如骨髓MSCs經(jīng)47℃熱休克損傷30 min，再與肝細胞共培養(yǎng)，利于其向肝細胞的分化。Wang等［18］的研究發(fā)現(xiàn)用物理刺激因素（體外沖擊波）可以刺激UCBMSCs的分化、擴增。

4.2 體內誘導分化為肝細胞 Tsai等［19］將經(jīng)熒光原位雜交和免疫組化標志的UCB-MSCs通過肝門靜脈注射給模型大鼠體內（四氯化碳腹腔內注射制造的肝壞死模型），移植8周后從大鼠肝組織內檢出了原位雜交和免疫組化陽性標志的人清蛋白mRNA。張麗欣等［20］用UCB-MSCs移植給失代償期肝硬化患者，移植后患者的轉氨酶、清蛋白等指標明顯好轉，原因可能與UCB-MSCs在慢性肝損傷時在體內分化為成熟的肝細胞有關。目前，UCB-MSCs在人體內的相關誘導分化研究較少，還待進一步動物實驗和臨床研究來證實。

4.3 分化為肝細胞的可能機制 多數(shù)學者認為UCB-MSCs分化為肝細胞的可能機制包括橫向分化和細胞融合兩種機制。橫向分化是指特定的細胞外信號激活啟動干細胞分化程序，通過基因重組，使某種已分化的細胞（在未發(fā)生細胞分裂的情況下）直接轉變成另一種分化的細胞過程。而細胞融合是指在HGF及FGF等內源性細胞因子刺激誘導下，細胞之間發(fā)生細胞質的混合及核基因的重組從而實現(xiàn)干細胞的分化。UCBMSCs的分化機制可能與選擇的肝損傷的不同模型、實驗方法、移植細胞的類型以及分析技術的方法有關。研究者在多數(shù)誘導分化實驗中未發(fā)現(xiàn)細胞融合現(xiàn)象，故多傾向于細胞橫向分化的機制可能性更大［21－22］。

5 UCB-MSCs原位肝移植治療終末期肝病

急、慢性肝損傷均有利于骨髓源性及臍血源性干細胞的形成和定植，其中慢性肝損傷對其更有利，提示肝纖維化或肝硬化可能更適于采取UCB-MSCs移植方法治療［23］。UCB-MSCs抗纖維化的可能機制：（1）UCB-MSCs通過直接抑制肝星狀細胞的激活或誘導肝星狀細胞的凋亡，分泌多種細胞生長因子、抗纖維化物質如HGF、G-CSF等，減少細胞外基質的積聚。（2）UCB-MSCs通過分化為有功能性的肝樣細胞，促進宿主體內內源性肝細胞的增殖。國內外學者［20，24］通過門靜脈或外周靜脈、肝動脈途徑對終末期肝病患者進行UCB-MSCs原位肝移植治療，術后患者肝功明顯好轉，無不良反應。

5.1 UCB-MSCs體內示蹤 師玲玲等［25］將綠色熒光蛋白標記的UCB-MSCs經(jīng)肝臟局部注射移植于肝壞死的大鼠模型，取大鼠肝組織做冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察標記的UCBMSCs遷徙途徑，移植治療48h移植細胞定居于匯管區(qū)，48h后熒光信號向壞死病灶區(qū)域遷徙，1周后一定數(shù)量的移植細胞在壞死區(qū)域彌散定居，免疫組化顯示鼠肝組織中有人類肝細胞特異性AFP、清蛋白（albumin，ALB）、Hep parⅠ標記蛋白表達。朱金海和陳燕凌［26］用二脒基苯基吲哚熒光標記UCBMSCs，由門靜脈注入大鼠肝移植受體，取肝組織冰凍切片，用熒光顯微鏡觀察UCB-MSCs定位于移植肝內。宗兆文等［27］構建增強型綠色熒光蛋白腺病毒載體，能有效地對大鼠體內的干細胞分布進行示蹤和定量分析。Theise等［28］將攜帶Y染色體的干細胞移植到雌性動物肝內，通過Y染色體成功示蹤。上述方法需要取得宿主的肝臟組織進行病理學檢查，這就對研究移植后的細胞在宿主體內的動態(tài)變化帶來了較大的困難。

磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）是目前在活體狀態(tài)下觀察干細胞體內示蹤的最常用的成像方法，居勝紅等［29］采用超順磁性氧化鐵標記UCB-MSCs，通過 MRI能較滿意地對標記后的UCB-MSCs在體內的遷移、肝內的定居及存活進行示蹤，可以較長時間（至少在移植后18周內）進行連續(xù)的動態(tài)觀察。

5.2 UCB-MSCs的移植途徑 目前UCB-MSCs移植的途徑分為以下兩類：（1）經(jīng)腹腔內注射或經(jīng)外周靜脈內輸注，該方式簡單、方便易行，但是移植的細胞不易進入肝臟定植，影響治療效果；（2）經(jīng)肝動脈或門靜脈、脾臟介入途徑，方式雖然有一定的創(chuàng)傷性，但移植的干細胞易于進入肝臟定植。張強等［30］研究表明經(jīng)肝動脈途徑既可以進行干細胞原位肝移植，同時在造影檢查時還發(fā)現(xiàn)了CT等檢查不能發(fā)現(xiàn)的多例AFP陰性的小肝癌。

5.3 影響 UCB-MSCs移植療效的因素 （1）UCB-MSCs的分離、誘導及體外培養(yǎng)條件。隨著體外培養(yǎng)時間的延長、傳代次數(shù)的增加，UCB-MSCs對趨化因子受體CXCR4表達量下降，從而減少基質細胞衍生因子-1介導的干細胞的遷移數(shù)量［31－32］。（2）移植的干細胞數(shù)量（臨床有效的移植要求干細胞的數(shù)量最好達到109以上）。（3）移植途徑直接影響干細胞在肝內的定植、增殖、分化。（4）干細胞移植的時機。（5）引起肝硬化的不同病因、患者的性別、體質量、年齡。（6）體內細胞因子水平。HGF、IL-3、IL-6、SCF等促進 UCB-MSCs細胞內外的CXCR4表達，增加UCB-MSCs的遷移能力；金屬蛋白酶－3組織抑制劑抑制 UCB-MSCs的遷移［33］。（7）受體營養(yǎng)狀態(tài)。受體血漿清蛋白濃度影響UCB-MSCs的遷移，調節(jié)血液中清蛋白的濃度，促進干細胞從高濃度部位向低濃度部位遷移［34］。（8）干細胞移植的次數(shù)。（9）其他：患者是否存在嚴重并發(fā)癥，如消化道出血、自發(fā)性腹膜炎等。

6 存在的問題

理論上講相對完善的干細胞移植應該具有以下特點：干細胞的來源和獲取不受倫理、道德、法律的束縛；分離純化方法簡單、重復性好、效率高；具有能方便識別的特異性細胞表面標記；能被有效凍存且復蘇后細胞的活性受影響??；在體外實驗中可實現(xiàn)細胞間功能的融合，但不會發(fā)生細胞間基因的平行轉移或結構的融合；可以被克隆分化，具有能分化為肝細胞或膽管細胞的生物學特性；在人體內能實現(xiàn)有效的擴增；在肝損傷的實驗模型中表現(xiàn)出臨床療效并且沒有潛在惡變的傾向［35］。目前UCB-MSCs治療終末期肝病的研究，尚未能完全具備以上條件。

UCB-MSCs自身即可表達少量的AFP及清蛋白mRNA。單純依靠檢測AFP及清蛋白mRNA等來判斷所誘導細胞系肝細胞可能出現(xiàn)假陽性［36］，僅僅依靠原有方法判斷所研究細胞是否系肝細胞凸顯出了不足之處。

大部分關于UCB-MSCs對終末期肝病的治療研究尚停留在體外實驗階段，僅有極少數(shù)在人體內治療的研究報道［37］。國內外學術界對UCB-MSCs在肝病治療中的作用仍存在較大的爭議。

7 UCB-MSCs在終末期肝病治療中的展望

雖然UCB-MSCs在肝病研究及治療領域中尚存在較多需要解決的問題，但與其他干細胞相比，具有以下優(yōu)點：（1）取材方便，易于收集，冷凍保存，不受倫理、道德和法律等方面的限制；（2）人臍帶MSCs含量豐富并且較為原始，分化能力更強；（3）UCB-MSCs不表達或低表達免疫排斥相關的標記，不需經(jīng)過嚴格配對使用，適宜于不同個體之間的移植，移植無免疫排斥反應或反應較弱，是細胞治療的理想靶細胞。隨著UCBMSCs的提取、分離培養(yǎng)、誘導分化方法的成熟，以及干細胞活體內示蹤研究進展，UCB-MSCs在終末期肝病的細胞移植中仍有著良好的應用前景。

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