WIG-1表達的調(diào)控及其在腫瘤和干細胞中的作用＊

李 坤 綜述，郭 偉，王如文審校

（第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所全軍胸外科中心，重慶 400042）

約50%的人上皮細胞腫瘤中能檢測到TP53突變，因此全面闡釋p53的功能是腫瘤學研究的核心問題之一［1］。在DNA損傷、癌基因活化、核苷酸耗竭和缺氧等多種應激因素刺激下，p53穩(wěn)定性增高，并被轉錄后修飾作用所激活，從而介導細胞發(fā)生G1／G2期停滯或凋亡，并參與細胞衰老、分化、DNA修復和基因組穩(wěn)定性的維持等過程［1－2］。作為轉錄因子，p53可與其下游靶基因啟動子的特異性位點結合，發(fā)揮正調(diào)節(jié)作用，如介導細胞周期阻滯的 p21、Gadd45、14-3-3σ和 Reprimo等，以及介 導 細 胞 凋 亡 的 Bax、Fas、PIG、PERP、Noxa、MCG-10、p53AIP1和PIDD等。此外，p53還能對凋亡抑制因子Bcl-2、IGF-1R和MAP4等發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用［3］。目前已知TP53中的DNA結合區(qū)發(fā)生突變，是腫瘤異常增殖的重要原因。進一步發(fā)掘p53在腫瘤中其他作用機制及其相關下游信號分子可能會對腫瘤的治療產(chǎn)生深遠的影響。

野生型 p53 誘 導 基 因 1（wild-type p53-induced gene 1，WIG-1）又被稱為PAG608或ZMAT3，是受p53直接調(diào)控的下游靶基因［3］。WIG-1基因定位于人類3號染色體長臂的26.3～27.0區(qū)（3q26.3～27.0）［3］；其開放閱讀框（ORF）編碼的蛋白包括兩種不同的轉錄本，分別含288或289個氨基酸；其3′非翻譯區(qū)（3′UTR）較長，并含有3個PolyA位點。WIG-1蛋白相對分子質(zhì)量為32×103，主要定位于胞核，也可表達于胞漿［4－5］，在成人的腦組織中高表達，腎和睪丸組織中中度表達；而在胎兒的腦、心臟、胰腺、腎上腺、肝和小腸組織中未檢測到表達［5］。WIG-1蛋白含有3個C2H2型鋅指結構，鋅指間存在特殊的空間結構，使 WIG-1蛋白對各種長度的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA），以及 miRNA樣 RNA（miRNA-like RNA）具有高度的親和力［6］。

1 WIG-1的結構和功能

WIG-1蛋白最顯著的特點是其含有3個C2H2型鋅指結構，該鋅指結構在從魚到人的多個物種間高度保守［7］。C2H2型鋅指蛋白（Cys2His2zinc finger proteins）的主要功能是識別特定的DNA片段，也可結合dsRNA、單鏈RNA（single-stranded RNA，ssRNA）、DNA-RNA雜合物、miRNA 樣 RNA 和其他蛋白［6］。WIG-1的3個C2H2型鋅指間連接序列較長（54～75個氨基酸），鋅指內(nèi)組氨酸間距較寬（5個氨基酸），其空間構型與JAZ和dsRBP-Zfa相似，具有典型的dsRNA結合蛋白的特點［3］。外源性WIG-1主要通過鋅指1和鋅指2與長鏈（50～100bp）dsRNA的5′突出部相結合，還可與短鏈（21bp）dsRNA（如siRNA和miRNA樣dsRNA）的3′突出部相結合，這說明WIG-1對各種長度的dsRNA均有高度的親和力［6］，并可能參與dsRNA和miRNA介導的調(diào)控作用。WIG-1能通過RNA依賴的方式與RHA和hnRNP A2／B1相互作用形成蛋白-RNA復合物，并參與 mRNA的加工和翻譯［8］。WIG-1也是一種ARE結合蛋白（ARE-binding protein，AUBP），可調(diào)節(jié)包括TP53在內(nèi)的靶mRNA的穩(wěn)定性。AREs介導的調(diào)控作用發(fā)生在胞漿，而WIG-1主要定位在胞核，并可在胞核和胞漿間穿梭，這與另一種AUBP-HuR相似［4］。因此 WIG-1可能還具有mRNA運輸、加工和剪接等與HuR相似的胞核功能。

2 WIG-1表達的調(diào)控

WIG-1是受p53直接調(diào)控的靶基因，其誘導上調(diào)具有wtp53依賴性，但可能還存在其他多樣化的調(diào)節(jié)方式。

1997年，Israeli等［9］以LTR6細胞作為研究對象，尋找受p53調(diào)節(jié)的下游靶因子。LTR6細胞來源于p53缺陷的小鼠髓樣白血病M1細胞，由M1細胞穩(wěn)定轉染溫度敏感性p53突變體p53val135形成。其特點是，在37℃條件下，p53val135蛋白主要表現(xiàn)為突變型，不具備wt－p53的生物學活性。當溫度降至32℃時，p53val135蛋白可恢復wt－p53構象，并引起大量wt-p53依賴的細胞凋亡。Israeli等［9］分別提取經(jīng)32℃降溫培養(yǎng)和37℃正常培養(yǎng)的LTR6細胞的RNA進行比較，通過差異顯示實驗獲得3種表達明顯增高的轉錄物，WIG-1即是其中之一。

WIG-1對p53活性改變的反應迅速、持久而靈敏。p53活化2h后，WIG-1表達即接近最大值；活化16h后，WIG-1表達仍明顯增高；活化4h后，WIG-1表達可增高10～20倍［9］。這些現(xiàn)象提示W(wǎng)IG-1可能是受p53直接調(diào)控的靶因子。Wilhelm等［10］對小鼠 WIG-1mRNA的部分啟動子序列進行克隆，通過凝膠電泳遷移率轉換實驗（EMSA）發(fā)現(xiàn)3個潛在的p53結合位點，并進一步通過熒光素酶報告基因實驗證實其中2個位點可與p53結合形成DNA－蛋白復合物，并驅動p53依賴的轉錄調(diào)控作用，說明WIG-1確實是p53的直接靶基因。

組織和細胞中WIG-1雖存在一定程度的固有表達，但其誘導上調(diào)需依賴具有正常功能的p53。多種p53val135細胞株（LTR6、C16、DP16）和p53沉默的 H1299細胞須經(jīng)p53活化或質(zhì)粒轉染方能誘導 WIG-1表達［9］；電離輻射后wt-p53小鼠胸腺組織中WIG-1mRNA含量較輻射前增高數(shù)倍，而p53敲除小鼠胸腺組織中 WIG-1mRNA含量輻射前后未見明顯改變［9］；表達wt－p53的HCT116和LoVo細胞經(jīng)X射線輻射后WIG-1表達明顯增高，而表達wt－p53的DLD1細胞 WIG-1表達輻射前后未見明顯改變［5］。

p53是WIG-1目前已證實，而非惟一的轉錄激活因子?！癙scan”數(shù)據(jù)庫分析顯示，WIG-1的啟動子序列可能存在多種轉錄因子的結合位點，如誘導成纖維細胞分化為肌細胞的Myf5；特異性表達于中樞神經(jīng)5-HT系統(tǒng)并與某些精神疾病密切相關的FEV；誘導巨噬細胞或B淋巴細胞分化并與造血系統(tǒng)惡性腫瘤密切相關的SPI1和HLF；促進精子發(fā)生的Spz1；維持胚胎干細胞自我更新和多向分化潛能的Sox2和Pou5f1；以及光感受器的特異性核受體Nr2e3等。這些轉錄因子廣泛分布于肌肉、腦、晶狀體、睪丸等器官組織以及造血細胞和胚胎干細胞等，均可能誘導 WIG-1表達上調(diào)［11］。因此p53可能并非WIG-1惟一的上游轉錄因子，腦可能也并非 WIG－1惟一高表達的器官。值得注意的是，上述潛在的轉錄因子中，Spz1、Pou5f1和SPI1具有促進細胞生長和（或）腫瘤發(fā)生的作用；而Pou5f1和Sox2則是胚胎干細胞存活的關鍵因子。因此各種環(huán)境狀態(tài)下的細胞均有可能發(fā)生WIG-1表達上調(diào)，而非僅限于生長抑制狀態(tài)?！癙antherdb”數(shù)據(jù)庫（http：／／www.pantherdb.org／）分析顯示，WIG-1可能參與多種信號通路，除了缺氧應激、凋亡和p53反饋環(huán)等p53相關通路外，還包括Interleukin、Insulin／IGF 蛋白激酶 B、TGF-β、PI3 激酶、PDGF、Ras、Toll受體、Wnt以及炎癥趨化因子／細胞因子介導的炎性反應等通路［11］。進一步說明，p53對 WIG-1的誘導作用固然確切和重要，但WIG-1可能還存在其他多樣化的調(diào)節(jié)方式。

3 WIG-1對p53的作用

WIG-1可通過作用于p53mRNA 3′UTR的AU富集元件（AU-rich elements，AREs），對p53發(fā)揮正反饋調(diào)節(jié)作用。

Asanuma等［12］采用siRNA抑制 U2OS等細胞中 WIG-1的表達后，發(fā)現(xiàn)p53表達降低；使用化療藥物對p53進行活化后，其表達仍低于對照組。p53的下游因子p21表達也顯著降低。反之，U2OS細胞中瞬時轉染外源性WIG-1可使p53表達提高80%以上［4］。抑制大鼠神經(jīng)元中WIG-1的表達可減弱甲基苯丙胺介導的p53依賴的細胞死亡。以上研究提示，WIG-1可能對p53及其相關生物學效應起正反饋調(diào)節(jié)作用。進一步研究顯示，WIG-1是一種AUBP，它可通過結合AREs增強p53mRNA的穩(wěn)定性，并促進p53蛋白的合成。

AREs通常位于某些表達需要精細調(diào)節(jié)的，特別是與細胞周期密切相關的 mRNA（如c-myc、c-fos、c-jun、p53和p21等）的3′非翻譯區(qū)（3′UTR），其中含有AUUUA序列或U富集區(qū)（U-rich region）。某些蛋白可直接作用于AREs，通過調(diào)控靶mRNA的穩(wěn)定性和轉錄活性，參與胚胎發(fā)育以及腫瘤、慢性炎癥和自身免疫性疾病等病理過程［13］。p53mRNA的3′UTR含有1段U富集區(qū)（18個連續(xù)的尿嘧啶）和1段額外的AUUUA序列。大多數(shù)蛋白與靶mRNA的AREs結合后，對靶mRNA的表達起負調(diào)節(jié)作用，但也有少數(shù)蛋白對靶mRNA的表達起正調(diào)節(jié)作用，WIG-1屬于后者。WIG-1蛋白與p53 mRNA 3′UTR的U富集區(qū)結合后，可阻止p53mRNA的脫腺苷化，防止其降解。這一穩(wěn)定作用可使p53蛋白表達上調(diào)，并增強p53對DNA損傷的應激反應，從而對p53發(fā)揮正反饋調(diào)節(jié)作用［4］。

研究認為WIG-1可能通過相同機制對其他攜帶AREs的mRNA發(fā)揮調(diào)控作用。如果這一猜測正確，將揭示一大批通過WIG-1介導的受p53調(diào)節(jié)的下游基因［13］。目前，已發(fā)現(xiàn)3 275個攜帶AREs的人蛋白編碼基因，約占人蛋白編碼基因總數(shù)的16%，其中有711個已被實驗證實是AUBP的靶基因，還建立了專用于查找mRNA中AREs的數(shù)據(jù)庫“AREsite”［14］。

4 WIG-1與腫瘤

WIG-1與腫瘤的關系目前尚存在爭議。體外研究表明，轉染外源性 WIG-1的Saos-2和HCT116細胞集落形成減少16%～50%［3，4，6］，說明 WIG-1對腫瘤細胞增殖有一定的抑制作用；而采用siRNA干擾WIG-1表達同樣對HCT116細胞增殖有抑制作用［8］。這說明 WIG-1表達須維持在適當?shù)乃?，表達過度或不足均會對細胞活力產(chǎn)生影響。有趣的是，WIG-1對細胞周期分布無明顯影響［3，8］。在各類腫瘤中，WIG-1表達下調(diào)和上調(diào)均有報道。如在乳腺浸潤性小葉癌中，WIG-1表達是正常乳腺的79%［15］。而在肺鱗癌中，WIG-1表達是正常肺的2.00倍［5］；在乳頭狀甲狀腺癌中，WIG-1表達是正常甲狀腺的3.36倍（Geoprofiles，GDS1732）；此外，WIG-1所在的染色體區(qū)（3q26.3～27.0）擴增頻繁出現(xiàn)在多種腫瘤中，包括頭頸、乳腺、卵巢、前列腺、食管、鼻咽和肺腫瘤以及急性髓樣白血病等，這提示上述部分腫瘤中可能存在 WIG-1上調(diào)。然而，WIG-1所在的染色體區(qū)還含有其他與腫瘤關系密切的基因，如hTR和BCL6等。因此目前尚不明確WIG-1在部分腫瘤中表達上調(diào)屬于自發(fā)性還是協(xié)同性。此外，已如上述，多種潛在的上游轉錄因子均可對 WIG-1發(fā)揮調(diào)控作用，其中有抑癌因子，也有促癌因子。因此作為p53的直接下游靶基因，目前卻難以將WIG-1明確的定義為抑癌或促癌因子。

5 WIG-1與干細胞

WIG-1在干細胞中表達增高，并對維持干細胞自我更新和多向分化潛能起重要作用。

多項基因表達譜研究表明，WIG-1可能對干細胞性的維持起重要作用。在小鼠胚胎干細胞（ESCs）、神經(jīng)干細胞（NSCs）和造血干細胞（HSCs）中，WIG-1表達均高于其各自對應的分化細胞［16］。另有研究顯示，小鼠 HSCs中Bmi-1的缺失伴隨著WIG-1的上調(diào)。Bmi-1是維持HSCs自我更新能力的重要因子，Bmi-1缺失的成年小鼠失去造血功能［17］，WIG-1上調(diào)可能對HSCs失活起促進作用，也可能是Bmi-1缺失后的代償機制。在紅細胞成熟過程中，WIG-1表達下調(diào)［18］。而在生殖細胞中，WIG-1可能受生長因子的誘導。如在精原干細胞（SSCs）中，WIG-1可在神經(jīng)膠質(zhì)細胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）的刺激下上調(diào)，而GDNF是抑制SSCs分化并維持其自我更新能力的重要生長因子［19］；從卵泡中分離出的卵丘-卵母細胞復合體（COCs）經(jīng)人絨毛膜促性腺激素（HCG）處理后，其WIG-1表達上調(diào)［20］?；蛐酒芯匡@示，未受精的卵母細胞至E4.5胚胎的 WIG-1表達維持在一定水平并輕度上調(diào)［21］；植入前期的胚胎可檢測到 WIG-1表達［22］。Chia等［23］發(fā)現(xiàn)，使用短發(fā)夾RNA（shRNA）進行 WIG-1敲除的hESCs，其干細胞表型減弱。此外，已如前述，Pou5f1和Sox2這兩個ESCs的關鍵轉錄因子，也是WIG-1的潛在調(diào)控因子；且WIG-1可能參與多種與ESCs發(fā)育相關的信號通路。以上研究均表明，WIG-1對干細胞功能的維持起著重要作用。

6 WIG-1研究展望

隨著對p53研究的深入，其相關信號傳導網(wǎng)絡被進一步發(fā)掘。目前認為，除了介導應激引起的細胞周期阻滯和凋亡，p53還參與其他多種生理和病理過程，如自噬、免疫、代謝、衰老、生殖、DNA修復、干細胞調(diào)節(jié)、神經(jīng)變性、缺血再灌注損傷和抑制血管生成等，而基礎水平的p53有助于細胞存活［1，2，24］。其中的部分研究結果與過去的觀點迥異甚至矛盾，這說明對p53的了解還遠遠不足。WIG-1是一種受p53直接調(diào)控的AUBP，其下游蘊藏著大量潛在的功能各異的靶基因，這將為闡釋p53生物學功能的多樣性開辟新的途徑。例如，攜帶AREs的蛋白編碼基因中包括大量生長促進因子（如cyclins、c-Jun、c-Fos和c-Myc）［25］，可能解釋為何細胞周期阻滯和促進凋亡并非p53的絕對調(diào)控方式的原因。然而，目前對WIG-1的認識還處于起始階段，對WIG-1的生物學功能及其相應的信號傳導途徑所知甚微，多數(shù)含WIG-1的基因芯片的研究結果尚須后續(xù)實驗進一步驗證，其在腫瘤和干細胞中的作用機制更有待于進一步明確。WIG-1在真核生物中高度保守，其研究將有助于探索細胞生理和病理過程中的普遍規(guī)律?？傊?，相信WIG-1能帶來更多激動人心的發(fā)現(xiàn)。

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