非血體液的γ－干擾素釋放檢測對結(jié)核感染的診斷價值

魏 娟綜述，汪芳裕審校

(本文編輯:張仲書)

隨著經(jīng)濟(jì)水平提高，衛(wèi)生條件改善，我國結(jié)核病的發(fā)病率有所下降，但結(jié)核感染的臨床表現(xiàn)也越來越不典型，為臨床診治帶來困難。對于接種過卡介苗、非結(jié)核桿菌感染、免疫缺陷人群，結(jié)核皮膚試驗(tuberculin skin test，TST)的臨床診斷能力有限;對于潛在結(jié)核感染及細(xì)菌培養(yǎng)陰性的活動性結(jié)核患者來說，也無檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，臨床上確診結(jié)核桿菌感染也比較困難，因此需要敏感性、特異性更佳的新診斷方法。

1 γ－干擾素釋放檢測(interferon gamma release assays，IGRAs)

1.1 IGRAs的定義 2001年美國食品藥品管理局(FDA)［1］將 IGRAs的第一代 Quanti FERON 結(jié)核檢測試驗(Quanti FERON－TB test，QFT)作為結(jié)核感染的診斷方法之一，在這之前僅有結(jié)核皮膚試驗廣泛地作為結(jié)核感染診斷的免疫試驗。在發(fā)達(dá)國家，外周血IGRAs被應(yīng)用于結(jié)核感染診斷中，但外周血IGRAs尚不能鑒別潛在性與活動性結(jié)核感染。有報道在活動性肺結(jié)核患者中，T細(xì)胞同源擴(kuò)散能被招募至感染部位［2］，因此通過酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(enzymelinked immunospotassay，ELISPOT) 的方法，對感染局部的效應(yīng)T細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，在提高活動性肺結(jié)核診斷的特異性方面優(yōu)于外周血。目前國內(nèi)外針對結(jié)核感染局部的非血性體液進(jìn)行的IGRAs研究，可能有助于提高結(jié)核感染診斷的敏感性及特異性。

1.2 IGRAs的分類 γ－干擾素 (IFN－γ)在調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起重要作用，故IGRAs通過檢測結(jié)核特異抗原誘導(dǎo)T細(xì)胞釋放IFN－γ來評估結(jié)核感染。第一代 IGRAs［3］是 Quanti FERON－結(jié)核試驗(Quanti FERON－TB test，QFT)，2001年由 FDA 允許作為診斷結(jié)核感染的方法之一，這是利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測由結(jié)核純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)刺激所產(chǎn)生的 IFN－γ的量。第二代 IGRAs［4］是 QFT 膠體金試驗(QuantiFERON－TB gold test，QFT－G)，利用結(jié)核特異性抗原即早期分泌的抗 原 靶 點(diǎn) 6(early secretory antigenic target－6，ESAT－6)和培養(yǎng)濾過蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP－10)刺激 IFN－γ 釋放的檢測。2007年第三代IGRAs誕生［5］，即QFT膠體金試管內(nèi)試驗(Quanti FERON－TB gold in－tube test，QFT－GIT)，將預(yù)置有肝素、葡萄糖、植物素的試管加入混有試劑的外周血，并與結(jié)核特異抗原孵育，判斷對結(jié)核特異抗原的反應(yīng)。2008年7月，F(xiàn)DA 認(rèn)定第四代 IGRAs［5］，即結(jié)核感染T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(T－ELISPOT tuberculosis，T－SPOT.TB)，實驗通過結(jié)核特異抗原即 ESAT－6和 CFP－10和外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)共同孵育，通過ELISPOT檢測分泌IFN－γ的細(xì)胞數(shù)來評估結(jié)核感染，其中每個斑點(diǎn)代表一個與相應(yīng)抗原反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞。

1.3 外周血IGRAs診斷結(jié)核感染的價值評價 有研究［6］表明在培養(yǎng)陽性的活動性結(jié)核感染人群中，評價 QFT－GIT的陽性和陰性人數(shù)，其敏感性為81%。有研究［7－9］表明在培養(yǎng)陽性的活動性結(jié)核感染人群中，評價T－SPOT.TB的陽性以及陰性人數(shù)，其敏感性為91%。在比較T－SPOT.TB和TST試驗的敏感性研究中，T－SPOT.TB敏感性是90%，TST敏感性是89%。研究表明［7，11］在不可能感染結(jié)核的人群中，QFT－GIT特異性是99%，TST特異性是85%，TST 的特異性明顯比 QFT－GIT 和 T－SPOT.TB低，TST假陽性的結(jié)果，可能因卡介苗(Bacillus Calmette－Guerin，BCG)接種或暴露于非結(jié)核菌所致。

目前研究發(fā)現(xiàn)，無論是 TST，還是外周血的IGRAs，都不能準(zhǔn)確地鑒別潛在結(jié)核感染、活動性感染以及抗癆治療后的感染。急性感染期間，有活性的T細(xì)胞主要積聚在炎癥反應(yīng)局部以對抗感染，故外周血中的效應(yīng)T細(xì)胞所占比例較少，研究炎癥局部的效應(yīng)T細(xì)胞的數(shù)量對診斷活動性結(jié)核疾病可能更有意義。

2 非血體液的IGRAs診斷結(jié)核的價值

2.1 胸腔積液和支氣管肺泡灌洗液 Wilkinson等［12］將10例結(jié)核患者的結(jié)核性胸腔積液濃縮后，測出其中T細(xì)胞比外周血的高15倍(標(biāo)準(zhǔn)差為6倍)，同時行體外T－SPOT.TB分析，結(jié)果提示胸腔積液中ESAT－6抗原特異的T細(xì)胞數(shù)量明顯高于外周血，可為結(jié)核性胸膜炎診斷提供新方法。2006年某個案報道［13］一名64歲德國老年女性，既往有克羅恩病史，近期應(yīng)用了他克莫司、氫化可的松、驍悉、英夫利昔等免疫抑制藥物，因胸腔積液就診，結(jié)核菌培養(yǎng)陰性。胸腔積液以及肺泡灌洗液、胸膜活檢、胸腔鏡活檢均未檢出抗酸桿菌。僅在胸膜病理活檢提示干酪樣肉芽腫，對外周血以及胸腔積液行T－SPOT.TB檢測，發(fā)現(xiàn)每250 000 PBMCs中含有104個ESAT－6特異T細(xì)胞，39個CFP－10特異T細(xì)胞;肺泡灌洗液中每250 000細(xì)胞中含178個ESAT－6特異T細(xì)胞，63個CFP－10特異T細(xì)胞，明顯高于外周血，經(jīng)胸膜組織活檢的結(jié)核特異PCR證實了結(jié)核感染，經(jīng)2周的抗癆治療后患者胸腔積液消失。說明即使患者在可能有免疫抑制的情況下，T－SPOT.TB對診斷活動性結(jié)核性胸膜炎也著重要作用，尤其是感染局部，對胸腔積液細(xì)胞的敏感性優(yōu)于外周血2009年有研究［14］也發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核感染患者肺泡灌洗液含有一定量的結(jié)核抗原特異性T反應(yīng)細(xì)胞。Jafari等［10］對37例疑似肺結(jié)核患者進(jìn)行研究，其中12例為痰涂片抗酸桿菌陰性的肺結(jié)核患者，25例為非肺結(jié)核患者。在12例肺結(jié)核患者中，每200 000 PBMCs中含有17 個 ESAT－6 特異 T 細(xì)胞，24.5 個 CFP－10 特異T細(xì)胞，在肺泡灌洗液中每200 000 PBMCs中含有含有37.5個 ESAT－6 特異 T 細(xì)胞，49.5 個 CFP－10特異T細(xì)胞;在對照組即非肺結(jié)核組中，每200 000 PBMCs中含有1個 ESAT－6特異 T細(xì)胞，1個 CFP－10特異T細(xì)胞，而在對照組的肺泡灌洗液中無活性細(xì)胞(P＜0.01)。此研究表明了，痰涂片抗酸桿菌陰性的肺結(jié)核患者，通過肺泡灌洗液中特異細(xì)胞的鑒定有助于準(zhǔn)確診斷。2007年歐洲結(jié)核聯(lián)合機(jī)構(gòu)組織了由4個研究中心參與的研究［15］，即選取20例具有臨床表現(xiàn)或影像學(xué)檢查懷疑的結(jié)核性胸膜炎患者為研究組，21例非結(jié)核所致的胸腔積液患者為對照組，對患者的 PBMCs及胸腔積液單核細(xì)胞(pleural effusionmononuclear cells，PEMCs)分別進(jìn)行T－SPOT.TB檢查。研究組中有18例 PBMCs的 TSPOT.TB陽性，占 90%;而有 19例 PEMCs的 TSPOT.TB陽性，占95%。在對照組中有7例PBMCs的T－SPOT.TB檢測陽性，占33%，而有5例PEMCs T－SPOT.TB 陽性，占 23%。PEMCs 的 T－SPOT.TB對于診斷活動性結(jié)核性胸膜炎的敏感性以及特異性分別是95%和76%，皆明顯優(yōu)于外周血。PEMCs中結(jié)核感染特異性細(xì)胞的計數(shù)在臨床上簡易可行，更有利于結(jié)核性胸膜炎的快速而準(zhǔn)確的診斷。Dheda等［16］以91例疑似結(jié)核感染的南非患者為研究對象，利用 ESAT－6、CFP－10、血凝素作為刺激抗原，通過 T－SPOT.TB、QFT－GIT 的方法進(jìn)行比較，結(jié)果提示，在明確診斷肺結(jié)核患者中T－SPOT.TB陽性率(58%)比痰涂法(29%)更高，血凝素和PPD刺激反應(yīng)作用較差，說明肺泡灌洗液細(xì)胞在結(jié)核特異抗原刺激下的IFN－γ反應(yīng)有助于快速診斷結(jié)核。

但同時有結(jié)果相悖的報道，2008年Chegou等［17］選取66例不明原因胸腔積液患者，抽取患者外周血和胸腔積液的樣本進(jìn)行游離IFN－γ水平檢測和QFT－GIT，比較兩者在結(jié)核診斷中的價值，結(jié)果提示，胸腔積液中游離IFN－γ水平是診斷結(jié)核性胸膜炎的更為準(zhǔn)確的生物標(biāo)記，優(yōu)于QFT－GIT。2009年Dheda等［18］選取南非78例疑似結(jié)核性胸膜炎所致的胸腔積液病例為研究對象，結(jié)果提示未行刺激的胸腔積液中IFN－γ水平的檢測對于結(jié)核感染的診斷更加精確，通過檢測特異性抗原刺激局部的T細(xì)胞IFN－γ分泌并不能增加其診斷價值。2009年Hooper等［19］綜述既往研究，認(rèn)為IGRAs比直接檢測胸腔積液中特征性的標(biāo)記物更加復(fù)雜和昂貴，檢測的結(jié)果多有波動，不穩(wěn)定，且不能排除活動性結(jié)核感染。2010年Krenke等［20］認(rèn)為，目前在活動性結(jié)核性胸膜炎的診斷中，無肯定的證據(jù)證明IGRAs診斷價值優(yōu)于胸腔積液中腺苷脫氨酶和IFN－γ水平檢測。

2.2 腦膜炎腦脊液的IGRAs 結(jié)核性腦膜炎患者中軟腦膜是結(jié)核感染的局部炎癥部位，其腦脊液可通過穿刺途徑獲得，故通過對腦脊液的分析，診斷結(jié)核感染是可行的。有報道［21］稱11例疑似結(jié)核性腦膜炎患者中，9例腦脊液的T－SPOT.TB具有很高的T細(xì)胞反應(yīng)。以上研究提示腦脊液T－SPOT.TB具有較高的敏感性。2008年Luca等［22］研究比較了外周血和腦脊液的QTF在診斷結(jié)核性腦膜炎中價值，發(fā)現(xiàn)全血中QTF的敏感性為78.57%，QTF在腦脊液中的特異性高于血，陽性預(yù)測率超過90%。腦脊液的QTF比腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)速度更快，敏感性更高，是診斷結(jié)核性腦膜炎的好方法。2008年Kim等［23］以37例中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核患者為研究對象，發(fā)現(xiàn)PBMCs的 T－SPOT.TB的敏感性、特異性分別為91%和63%，而腦脊液T－SPOT.TB的敏感性和特異性均為75%。此報道提示腦脊液T－SPOT.TB在診斷結(jié)核性腦膜炎中具有很高的特異性，PBMCs和腦脊液T－SPOT.TB檢查能提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核感染的準(zhǔn)確性。2010年P(guān)atel等［24］證明，利用腦脊液中單核細(xì)胞的結(jié)核特異抗原刺激的 T－SPOT.TB，在診斷結(jié)核感染方面具有快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)。但是 Méndez Echevarría 等［25］指出 QFT－GIT 在某個患有結(jié)核性腦膜炎的兒童的診斷上缺乏敏感性。

2.3 腹水的IGRAs 2009年我國協(xié)和醫(yī)院張麗帆等［26］報道，利用結(jié)核特異抗原刺激外周血、胸腹水、腦脊液的單核細(xì)胞，計數(shù)釋放IFN－γ特異性T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腹水中斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)是外周血的31.9倍。與PBMCs的 T－SPOT.TB相比，腹水中的檢測可能更準(zhǔn)確地診斷腹膜結(jié)核感染。Lorenz等［27］報道某20歲女性，因腹水、乏力、盜汗、低熱等癥狀入院，痰涂片抗酸桿菌陰性，腹水和糞便結(jié)核PCR陰性，而腹水和PBMCs的QFT－G陽性。腹膜活檢標(biāo)本的細(xì)菌培養(yǎng)陽性和診斷性抗癆治療證實患者為結(jié)核性腹膜炎，說明了腹水的QFT－G對診斷結(jié)核性腹水有一定的診斷價值。

3 結(jié)語

結(jié)核桿菌培養(yǎng)周期長，盡管國內(nèi)有報道［28］經(jīng)皮穿刺腹膜活檢結(jié)核明確診斷率為30.8%，但結(jié)核感染組織活檢標(biāo)本收集仍有難度，且抗酸桿菌檢測陽性率低，結(jié)核的PCR檢測易污染、費(fèi)用高，多種因素導(dǎo)致臨床上結(jié)核感染診斷困難。目前在國際上外周血的IGRAs已是診斷結(jié)核感染的常用方法。結(jié)核感染時，有活性的T細(xì)胞主要積聚在炎癥反應(yīng)局部如胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液、腹水、腦脊液、腸道灌洗液，這些標(biāo)本較易獲得，故計數(shù)其中效應(yīng)T細(xì)胞對診斷活動性結(jié)核疾病顯得更有意義，有利于準(zhǔn)確診斷結(jié)核感染。但目前國內(nèi)外針對非血性體液IGRAs研究樣本量偏小，代表性不強(qiáng)，其真正的診斷準(zhǔn)確度尚無定論，且與外周血IGRAs比較，其陽性的界定點(diǎn)尚需要統(tǒng)一，試驗結(jié)果假陽性代表何意義尚不明了。故需要大樣本多中心的研究，試驗方法也應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化、統(tǒng)一化，為迅速準(zhǔn)確地診斷結(jié)核感染提供幫助。

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