不同濃度苦參堿、大蒜素對人胃癌細胞株MKN-45殺傷作用的實驗研究

佘玉清 陳昱倩 顏延鳳 鞠娟 李芳 韓康生

（南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇南京 210014）

不同濃度苦參堿、大蒜素對人胃癌細胞株MKN-45殺傷作用的實驗研究

佘玉清 陳昱倩 顏延鳳 鞠娟 李芳 韓康生

（南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇南京 210014）

目的：觀察不同濃度苦參堿、大蒜素對人胃癌細胞株MKN-45體外生長的影響。方法：體外培養(yǎng)人胃癌細胞株MKN-45，分別用不同濃度的苦參堿、大蒜素處理，采用CCK-8法檢測MKN-45細胞的生長情況。結(jié)果：不同濃度的苦參堿及大蒜素作用于MKN-45細胞后，對其增殖均表現(xiàn)出了明顯的抑制作用，并表現(xiàn)出濃度與作用時長的依賴性，最高抑制值分別達到了96.82%和93.44%。結(jié)論：苦參堿及大蒜素可以抑制胃癌MKN-45細胞的增殖，且與作用時間、劑量呈正相關(guān)。

苦參堿 大蒜素 胃癌MKN-45細胞 實驗研究

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率較高，為胃癌治療尋找高效低毒的植物提取藥，已成為目前的研究熱點[1]?？鄥A是中藥材苦參、山豆根的主要活性成分，具有抗炎、抗纖維化、抗病毒等生物學活性。近年來，國內(nèi)外醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)苦參堿在抗癌方面具有明顯功效[2]。大蒜素具有抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂等功能，對乳腺癌、皮膚癌、結(jié)腸癌等均有抑制作用。流行病學研究表明，長期大量食用大蒜素者胃癌的發(fā)病率、死亡率均明顯下降，大蒜的年攝入量與胃癌發(fā)病率成負相關(guān)[3]。此次我們通過體外實驗研究不同濃度的大蒜素與苦參堿對人胃癌細胞株MKN-45的增殖是否具有明顯的抑制作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 實驗材料

1.1 細胞與試劑人胃癌MKN-45細胞為本實驗室保存，購自上海生命科學院細胞所。DMEM細胞培養(yǎng)基購自Inventrogen公司，胎牛血清購自杭州四季青試劑公司，CCK-8購自Sigma公司。大蒜素注射液購自山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，苦參堿注射液購自廣州明興制藥廠。

1.2 細胞培養(yǎng)人胃癌MKN-45細胞在37℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清（加青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL）的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。

2 實驗方法

2.1 分組實驗分為苦參堿組、大蒜素組及陰性對照組。苦參堿終濃度分別為0.05、0.10、0.25、0.50、1.0mg/mL，大蒜素終濃度分別為5、15、25、30、40μg/mL。另設不加藥的陰性對照組，僅加入等體積的DMEM細胞培養(yǎng)液。

2.2 CCK-8法檢測兩種藥物對MKN-45胃癌細胞的增殖抑制作用取對數(shù)生長期MKN-45細胞，0.25%胰酶消化制成細胞懸液，細胞濃度1×105/mL接種于96孔板中，每孔90μL，空白孔加入90μL DMEM，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。后按一定質(zhì)量濃度梯度分別加入苦參堿、大蒜素，每孔100μL，陰性對照組加入等體積DMEM液，每個濃度3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)6、24、48、72h后，每孔加入CCK-8 10μL繼續(xù)培養(yǎng)4h，酶標儀450nm波長下測定各孔吸光度A值，按下列公式計算抑制率：細胞增殖抑制率=[1－（A給藥組－A空白孔）／（A陰性對照組－A空白孔）]×100%。以上實驗重復3次。

2.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS16.0軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，變量均采用（x±s）表示，兩樣本均數(shù)間的比較用t檢驗，多樣本均數(shù)間比較用單因素方差分析，統(tǒng)計學差異的標準為P＜0.05。

3 實驗結(jié)果

3.1 苦參堿注射液對人胃癌MKN-45細胞增殖抑制率的影響見表1。當苦參堿濃度為0.05mg/mL時，48h抑制率為5.73%，72h抑制率為6.43%。但當濃度增加到1.0mg/mL時，48h抑制率為90.81%，72h抑制率更是達到了96.82%。這說明苦參堿注射液在濃度為0.05～1.0mg/mL范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加和處理時間的延長，對MKN-45細胞的增殖抑制率逐漸增加，存在時間和劑量依賴性（P＜0.01），各個濃度的生長抑制率之間存在顯著性相關(guān)（ANOVA，P=0.000）。

表1 不同濃度苦參堿不同作用時間對胃癌細胞株MKN-45的增殖抑制率（x±s，n=9）%

3.2 大蒜素對MKN-45細胞增殖抑制率的影響見表2。隨著大蒜素濃度的增加和作用時間的延長，對MKN-45細胞的增殖抑制率逐漸增加，且各個濃度的生長抑制率之間存在顯著性相關(guān)（ANOVA，P=0.000）。在大蒜素濃度為5μg/mL時就出現(xiàn)了對人胃癌MKN-45細胞株的增殖抑制作用，48h與72h增殖抑制率分別為4.88%與5.91%；當大蒜素濃度增加到40μg/mL時，48h與72h增殖抑制作用最強，分別為92.57%與93.44%。

4 討論

惡性腫瘤是中國人的第二大死因，而在我國因胃癌引發(fā)的死亡居惡性腫瘤死亡首位[4]。目前經(jīng)典的化療藥物因毒副作用較大和化療耐藥限制了其在臨床的應用，傳統(tǒng)中藥逐漸成了目前較熱門的抗腫瘤研究方向。

近年來，體外實驗研究中發(fā)現(xiàn)苦參堿可明顯地誘導骨肉瘤、人乳腺癌及肝癌細胞等的凋亡[5-7]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的苦參堿均可以明顯抑制人胃癌MKN-45細胞的增殖，在一定的濃度范圍內(nèi)（0.05～1.0mg/mL），其對人胃癌MKN-45細胞的增殖抑制與時間和濃度呈正相關(guān)。其抗腫瘤的作用機制主要包括誘導腫瘤細胞凋亡、分化、自噬以及細胞毒等多種作用[8-9]。林氏等[10]研究表明，苦參堿可明顯抑制黏附因子CD44、CD49的表達，抑制腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞的黏附，減輕內(nèi)皮細胞的通透性，從而減少腫瘤的轉(zhuǎn)移。Dai等[11]發(fā)現(xiàn)苦參堿可抑制胃癌細胞系SGC-7901的增殖，并可使細胞的形態(tài)學發(fā)生變化，還可導致細胞的caspase-3含量明顯升高，從而促進細胞凋亡。

大蒜素的抗癌作用在對照人群研究和臨床研究中已經(jīng)被證實，其作用機制主要有抑制致癌物的激活、抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲、誘導細胞凋亡、影響細胞周期、對細胞骨架的破壞作用、抑制血管生成等[12]。大蒜素的主要成分為二烯丙基三硫，占40%以上。二烯丙基三硫?qū)ξ敢褐蟹蛛x出的硝酸鹽還原菌的生長及其產(chǎn)生亞硝酸鹽的能力均有明顯的抑制作用。已有大量動物實驗證實，大蒜素具有預防胃癌發(fā)生的作用。本研究結(jié)果進一步顯示了大蒜素在體外對人胃癌MKN-45細胞的增殖具有抑制作用，并且隨著大蒜素藥物的濃度和用藥時間的增加，其增殖抑制作用就更為明顯。研究表明，大蒜素可通過第二信號系統(tǒng)cAMP、PKC途徑，增強細胞凋亡始動基因fas及凋亡促進基因box表達，抑制凋亡抑制基因bcl-2的表達，從而提高細胞凋亡率，誘導胃癌細胞凋亡，并抑制其增殖活性，揭示了大蒜素誘導胃癌細胞凋亡的機制[3]。

綜上所述，苦參堿和大蒜素注射液在體外可直接抑制或殺傷人胃癌MKN-45細胞，具有較強的增殖抑制及殺傷能力，并且呈現(xiàn)與時間和濃度的正相關(guān)性。因此，這兩種藥物都是具有廣泛應用前景的抗腫瘤藥物。

表2 不同濃度大蒜素不同作用時間對胃癌細胞株MKN-45的增殖抑制率（±s，n=9）%

表2 不同濃度大蒜素不同作用時間對胃癌細胞株MKN-45的增殖抑制率（±s，n=9）%

注：同一時間不同濃度與陰性對照組比較均P＜0.01；同一濃度不同時間比較均P=0.000。

0（陰性對照組）6h 5μg/mL2.83±1.734.71±0.894.88±0.685.91±1.33 15μg/mL6.92±2.978.91±1.8214.82±3.5717.93±5.37濃度24h48h 0 72h 0 0 0 25μg/mL11.83±2.8620.56±2.1125.28±4.4432.78±6.91 30μg/mL26.91±5.5739.91±5.1968.45±8.2461.95±4.90 40μg/mL39.96±4.8868.44±11.7492.57±9.9293.44±6.99

[1]朱艷琴，魯光華，徐玉芳.MTT法檢測體外培養(yǎng)人胃癌細胞株MGC-803對苦參素注射液的藥物敏感性.中國藥理學通報，2006，22（10）：1278

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[12]蔣淑婉，李云，陳鶴.大蒜素的抗腫瘤作用及其機制研究進展.醫(yī)學綜述，2013，19（8）：1420

編輯：吳寧

R735.2

A

1672-397X（2014）11-0082-02

佘玉清（1971-），女，醫(yī)學碩士，副主任中醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。Susan710316@163. com

2014-06-18