養(yǎng)陰活血合劑對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的腎保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制研究

周婷 屈長(zhǎng)宏 蔣紅心 廖建春 茆俊卿 劉曉靜 黃萍

（揚(yáng)州市中醫(yī)院，江蘇揚(yáng)州 225002）

養(yǎng)陰活血合劑對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的腎保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制研究

周婷 屈長(zhǎng)宏 蔣紅心 廖建春 茆俊卿 劉曉靜 黃萍

（揚(yáng)州市中醫(yī)院，江蘇揚(yáng)州 225002）

目的：觀察中藥養(yǎng)陰活血合劑對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）腎損害的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。方法：將20只12周齡的雄性SHR大鼠隨機(jī)分為SHR組、中藥組、安博維組和聯(lián)合組，每組5只，同時(shí)設(shè)5只同齡Wistar-Kyoto（WKY）大鼠作為正常對(duì)照組。中藥組和安博維組分別予養(yǎng)陰活血合劑（等效劑量為每日15g/kg）和安博維（等效劑量為每日30mg/kg）灌胃，每日1次；聯(lián)合組則給予養(yǎng)陰活血合劑加安博維灌胃，每日1次；SHR組和正常對(duì)照組均給予等量的蒸餾水每日1次灌胃。共治療及喂養(yǎng)8周，監(jiān)測(cè)尾動(dòng)脈血壓。在實(shí)驗(yàn)開始給藥前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后留取小便標(biāo)本及血標(biāo)本，檢測(cè)尿β2-微球蛋白（β2-MG）和尿微量白蛋白（mALB）及血尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）。采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）mRNA和內(nèi)皮素1（ET-1）mRNA的表達(dá)。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)前SHR各組血壓均顯著高于WKY組；實(shí)驗(yàn)后與實(shí)驗(yàn)前相比，中藥組、安博維組和聯(lián)合組大鼠血壓均明顯下降。實(shí)驗(yàn)后SHR組大鼠尿mALB、β2-MG較實(shí)驗(yàn)前明顯升高，中藥組、安博維組則明顯下降，聯(lián)合組下降更明顯。實(shí)驗(yàn)后中藥組、安博維組及聯(lián)合組大鼠尿mALB、β2-MG均明顯低于SHR組。與SHR組相比，中藥組、安博維組、聯(lián)合組腎組織TGF-β1和ET-1 mRNA的表達(dá)均顯著下降。結(jié)論：養(yǎng)陰活血合劑可降低SHR大鼠血壓，降低尿微量蛋白，其腎保護(hù)作用機(jī)制可能與其下調(diào)腎組織TGF-β1mRNA和ET-1mRNA表達(dá)的功能有關(guān)。

養(yǎng)陰活血合劑 自發(fā)性高血壓 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1內(nèi)皮素-1 實(shí)驗(yàn)研究

近年來，隨著高血壓的發(fā)病率逐漸增高，對(duì)于高血壓引起的腎損害越來越受到人們的重視。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)高血壓早期腎臟就已出現(xiàn)了異常改變，因此對(duì)于高血壓引起的腎損害的早期診斷和早期治療就顯得頗為重要。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)陰活血合劑對(duì)高血壓早期腎損害患者具有顯著的療效，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究養(yǎng)陰活血合劑對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠早期腎損害的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）20只，Wistar-Kyoto（WKY）大鼠5只，SPF級(jí)，雄性，12周齡，平均體重（280±20）g，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 藥物養(yǎng)陰活血合劑由熟地黃15g、山茱萸15g、何首烏15g、枸杞子15g、丹參15g、川芎10g、水蛭10g、川牛膝10g、澤蘭10g、天麻10g、鉤藤10g、丹皮10g組成，由揚(yáng)州市中醫(yī)院制劑室煎制，煎制成濃度1.5g/mL的藥液。安博維（厄貝沙坦），150mg/片，杭州賽諾菲安萬民生制藥有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑與儀器Trizilo試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Fermentas公司）；PCR試劑和TaqDNA聚合酶（美國(guó)Fermentas公司）；瓊脂糖凝膠（英國(guó)OSOID公司）；DNA Marker（美國(guó)Fermentas公司）；10mg/mL溴化乙錠（美國(guó)Sigma公司）；美國(guó)ABI17900實(shí)時(shí)定量PCR儀；DSWY-1大鼠尾動(dòng)脈血壓測(cè)量裝置（上海欣曼科教設(shè)備有限公司）；RM6240生物信號(hào)采集系統(tǒng)（成都儀器廠）；全自動(dòng)生化分析儀（西班牙DIAGNOSTIC）；低速離心機(jī)（日立7060型，日本日立公司）；超低溫冰箱（SANYOMDF-U71V型，日本）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與給藥25只大鼠予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將20只SHR大鼠隨機(jī)分為SHR組、中藥組、安博維組和聯(lián)合組，每組5只，另取5只同齡WKY大鼠作為正常對(duì)照組。中藥組予以養(yǎng)陰活血合劑灌胃，每日1次，根據(jù)大鼠與人的體表面積比例，按人每公斤體重的臨床日用量折算大鼠的等效劑量，大鼠中藥等效劑量為15g/（kg·d）。安博維組給予安博維灌胃，每日1次，安博維的等效劑量為30mg/（kg·d）。聯(lián)合組則給予養(yǎng)陰活血合劑加安博維灌胃，每日1次。正常對(duì)照組和SHR組均給予等量蒸餾水每日1次灌胃。各組均治療并喂養(yǎng)8周。

2.2 血壓測(cè)量測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈血壓，實(shí)驗(yàn)前測(cè)1次，實(shí)驗(yàn)后第1、2周各測(cè)血壓1次，以后每隔2周測(cè)血壓并記錄，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每記錄1次測(cè)血壓3次，取均值。

2.3 生化指標(biāo)檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)開始給藥前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1天清晨留取小便標(biāo)本，采用放射免疫法檢測(cè)尿β2-微球蛋白（β2-MG）和尿微量白蛋白（mALB）含量。在實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取血標(biāo)本1mL，用以檢測(cè)血尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）。

2.4檢測(cè)大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）mRNA和內(nèi)皮素1（ET-1）mRNA的表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-polymerase chainreaction，RT-PCR）技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。斷頭處死大鼠后，迅速取腎臟，Trizol試劑提取總RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)。內(nèi)參照引物（Gapdh）上游引物：ACTTTGGCATCGTGGAAGGG，下游引物：ACTTGGCAGGTTTCTCCAGG；TGF-β1上游引物：AGGGCTACCATGCCAACTTC，下游引物：CCACGTAGTAG ACGATGGGC；ET-1上游引物：ATCAGAGCAACCAGACA CCG，下游引物：TGCACTTCCTTCTCAGCTCG。PCR反應(yīng)體系25μL，含2μL DNA模板，上游引物及下游引物（10μmol/μL）各1μL，12.5μL SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ，8.5μL滅菌蒸餾水。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s；95℃5s、60℃30s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)延伸結(jié)束檢測(cè)熒光信號(hào)。隨后是一個(gè)緩慢升溫的程序，同時(shí)連續(xù)檢測(cè)DNA產(chǎn)物的溶解曲線，以了解樣品擴(kuò)增的特異性，保障測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。然后用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，相對(duì)表達(dá)量＝2-ΔΔCt。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，P＜0.05示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后尾動(dòng)脈血壓比較實(shí)驗(yàn)前SHR大鼠各組血壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均顯著高于正常對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)后與實(shí)驗(yàn)前相比，中藥組大鼠血壓顯著下降（P＜0.05），安博維組和聯(lián)合組下降更顯著（P＜0.001），提示中藥養(yǎng)陰活血合劑有一定的降壓作用。見表1。

3.2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后腎功能比較實(shí)驗(yàn)前后各組大鼠BUN、Scr含量比較均無明顯差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)后SHR組mALB、β2-MG較實(shí)驗(yàn)前明顯升高（P＜0.01），中藥組、安博維組則明顯下降（P＜0.05），聯(lián)合組下降更明顯（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)后中藥組、安博維組及聯(lián)合組尿mALB、β2-MG明顯低于SHR組（P＜0.01）。見表2。

3.3 各組大鼠實(shí)驗(yàn)后腎組織TGF-β1和ET-1 mRNA表達(dá)比較與SHR組相比，中藥組、安博維組、聯(lián)合組大鼠腎組織TGF-β1和ET-1 mRNA的表達(dá)均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

4 討論

高血壓病腎臟損害的病理表現(xiàn)主要為腎小動(dòng)脈硬化，入球小動(dòng)脈、小葉間動(dòng)脈玻璃樣變性和間質(zhì)纖維化，其中腎間質(zhì)纖維化是高血壓病腎臟損害的重要病理基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）在腎間質(zhì)纖維化過程中起到重要的作用。TGF-β1可促進(jìn)ECM蛋白的生成和沉積，降低蛋白酶的生成而減少基質(zhì)降解[1]，可促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞肥大；使腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，成為肌成纖維細(xì)胞；促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腎小管萎縮、腎功能損害[2]。王甜等[3]研究發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠腎臟組織TGF-β的表達(dá)隨周齡和血壓的增加而升高，與β2-MG的變化趨勢(shì)一致，可以作為早期腎損害的診斷指標(biāo)。ET-1是參與了高血壓腎損害的另外一種重要的因子，是血管強(qiáng)力收縮劑，可顯著減少腎臟血流量（RBF）和腎小球?yàn)V過率（GFR）。ET-1還可促使腎臟血管平滑肌細(xì)胞的增生，腎小球系膜細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)腎小球硬化的形成與發(fā)展，加重高血壓時(shí)腎功能損害的程度。有研究發(fā)現(xiàn)，16個(gè)月齡的自發(fā)性高血壓大鼠存在明顯的腎損害，血漿和腎組織中的ET含量也明顯升高，提示ET可能參與了SHR的腎損害[4]。

高血壓早期腎損害階段，腎臟沒有明顯的結(jié)構(gòu)和功能改變，缺少相關(guān)的臨床癥狀和體征，尿素氮和肌酐在早期不能反映腎小球的濾過功能，用常規(guī)的檢測(cè)方法難以較早判斷腎臟損害情況。而尿mALB在腎小球輕度受損時(shí)即明顯升高，標(biāo)志著腎小球?yàn)V過膜電荷選擇性屏障損傷，是腎小球早期損害的敏感指標(biāo)。β2-MG是體內(nèi)所有有核細(xì)胞的固有成分，幾乎全部由腎小球?yàn)V過，99%被腎小管重吸收，是判斷腎小管、腎間質(zhì)損害的敏感指標(biāo)。尿mALB和β2-MG聯(lián)合檢測(cè)可以早期發(fā)現(xiàn)腎臟損害。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SHR大鼠在13周時(shí)即有尿mALB、和β2-MG的顯著升高，且隨著周齡的增加而升高（P＜0.01）。

中醫(yī)認(rèn)為高血壓早期腎損害病位主要在肝腎兩臟，以肝腎陰虛、肝陽上亢為主要病理基礎(chǔ)，瘀血為主要病理因素?！秲?nèi)經(jīng)·素問》云：“腎者主水，受五臟六腑之精而藏之”，“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也”。腎虛，封藏失司，不能固澀精微，致精微外泄；肝腎陰虛，脈道失濡，血行不暢，腎絡(luò)瘀阻，且“久病必瘀”，瘀阻腎絡(luò)，清濁不分，精微壅而外溢，皆可出現(xiàn)尿mALB、β2-MG升高等高血壓早期腎損害的表現(xiàn)。據(jù)此理論，中醫(yī)治療立法以養(yǎng)陰活血為主，方中熟地黃、山茱萸、何首烏、枸杞子補(bǔ)肝腎，益精血，固澀精微；丹參、水蛭、川芎、丹皮、川牛膝活血化瘀通絡(luò)，川牛膝又引藥下行，丹皮兼清肝熱；天麻、鉤藤平息肝陽；澤蘭活血利水。全方共奏養(yǎng)陰活血、固攝精微之功效。前期研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)陰活血合劑可顯著降低高血壓合并早期腎損害患者的尿mALB、β2-MG和24h尿蛋白[5-6]。本研究通過養(yǎng)陰活血合劑治療自發(fā)性高血壓大鼠的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)陰活血合劑能降低SHR大鼠的血壓，顯著降低尿mALB和尿β2-MG，具有保護(hù)高血壓腎臟損害的作用，安博維與養(yǎng)陰活血合劑合用則有協(xié)同作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)陰活血合劑和安博維都可顯著抑制SHR大鼠腎臟組織TGF-β1和ET-1 mRNA的表達(dá)，兩者合用則作用更明顯，顯示養(yǎng)陰活血合劑可通過抑制腎組織TGF-β1和ET-1 mRNA的表達(dá)，進(jìn)而抑制高血壓引起的腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化，從而起到腎保護(hù)的作用。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后尾動(dòng)脈血壓比較（±s）mmHg

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后尾動(dòng)脈血壓比較（±s）mmHg

注：與本組0周時(shí)比較，△P＜0.05，△△△P＜0.001；與同時(shí)期SHR組比較，▲P＜0.05，▲▲▲P＜0.001。

組別動(dòng)物數(shù)（只）0周8周正常對(duì)照組5108.6±8.050110.6±7.335 5177.2±11.17中藥組5177.0±8.436154.4±6.044△▲安博維組5177.5±9.678118.0±11.76△△△▲▲▲聯(lián)合組5174.8±8.402106.0±6.356△△△▲▲▲SHR組171.2±2.588

表2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后尿微量白蛋白、β2微球蛋白、尿素氮及肌酐比較（±s）

表2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)前后尿微量白蛋白、β2微球蛋白、尿素氮及肌酐比較（±s）

注：與本組實(shí)驗(yàn)前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與同時(shí)期SHR組比較，##P＜0.01。

組別動(dòng)物數(shù)（只）正常對(duì)照組5 BUN（mmol/L）實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)后實(shí)驗(yàn)前6.2±1.5 6.5±2.852.6±8.1 68.2±7.1**54.8±7.386.4±5.9**中藥組56.4±1.7 7.6±3.155.8±3.6 59.0±7.536.9±4.628.5±5.7*##56.1±6.243.2±9.3*##安博維組57.2±1.1 7.0±2.560.3±5.7 62.5±5.340.1±3.527.3±8.0*##52.7±5.839.5±8.7*##聯(lián)合組56.7±2.6 7.4±1.658.9±7.2 63.8±6.139.5±4.315.4±5.6**##56.8±8.129.3±6.4**##實(shí)驗(yàn)前12.4±3.2 β2-MG（μg/L）實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)后5.9±2.46.3±3.1 6.8±3.0 8.5±2.453.5±5.4 67.2±2.138.7±5.2 Scr（μmol/L）實(shí)驗(yàn)后58.5±9.4 mALB（mg/L）實(shí)驗(yàn)后15.1±2.6 SHR組5

表3 各組TGF-β1和ET-1mRNA表達(dá)的變化（2-ΔΔCt）

[1]Schnaper H，Hayashida T，Hubchak SC，et al.TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis.Am JPhysiol Renal Physiol，2003，283（2）：243

[2]Li JH，Huang XR，Zhu HJ，et al.Role of TGF-beta signaling in extracellular matrix productionnunder high glucose conditions. Kidney Int，2003，63（6）：2010

[3]王甜，李靜，時(shí)曄，等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β與結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在自發(fā)性高血壓大鼠腎臟的增齡性變化.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2012，41（8）：952

[4]王小丹，鄭秋甫，谷慶陽，等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和內(nèi)皮素在自發(fā)性高血壓大鼠腎損害中的作用.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2000，25（4）：270

[5]周婷.中西藥合用治療高血壓病早期腎損害療效研究.遼寧中醫(yī)雜志，2008，35（2）：256

[6]周婷，屈長(zhǎng)宏.養(yǎng)陰活血方聯(lián)合安博維治療高血壓病早期腎損害患者30例.中醫(yī)雜志，2009，50（11）：1009

R544.105

A

1672-397X（2014）11-0077-03

周婷（1963-），女，本科學(xué)歷，主任中醫(yī)師，主要從事腎臟疾病的中西醫(yī)結(jié)合診治研究。Yzzt11757@163.com

2014-05-26

編輯：吳寧

江蘇省中醫(yī)藥局科技項(xiàng)目（LZ11168）