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    鹿茸中次黃嘌呤的超聲輔助提取法研究

    2012-08-15 00:42:18梁芳慧靳丹虹董麗丹
    中國實(shí)用醫(yī)藥 2012年11期
    關(guān)鍵詞:次黃嘌呤冰醋酸鹿茸

    梁芳慧 靳丹虹 董麗丹

    鹿茸為鹿科動(dòng)物梅花鹿(Cervus nippon Temminch)或馬鹿(Cervus elaphus Linnaeus)的雄鹿密生茸毛的未骨化的幼角[1]。鹿茸具有增強(qiáng)免疫功能、抗氧化、抗疲勞和抗衰老等藥理作用[2]。在抗氧化及抗衰老作用中,鹿茸中的次黃嘌呤、對羥基苯甲醛和磷脂會(huì)抑制與神經(jīng)系統(tǒng)老化有關(guān)的單胺氧化酶(MAO)的活性[3]。目前,測定次黃嘌呤含量的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)和高效毛細(xì)管電泳法[4,5]。本文將超聲輔助提取與反相高效液相色譜結(jié)合測定經(jīng)焙干處理后鹿茸樣品中的次黃嘌呤的含量,并采用正交設(shè)計(jì)法對提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。本方法簡便、準(zhǔn)確、可靠,適用于焙干鹿茸樣品中次黃嘌呤的定量分析。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試藥 高效液相色譜儀(安捷倫1200型),KQ5200超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司),JB/T5374-1991電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

    次黃嘌呤對照品(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司,含量>98%,批號:20040815);超純水,甲醇(色譜純),乙醇(分析純),冰醋酸(分析純)均購于天津大學(xué)科威公司;鹿茸經(jīng)切片,焙干粉碎后過100目篩(鹿茸來源,長春市雙陽鹿場)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱:AgilentTC C18(250 mm×416 mm,5 μm);流動(dòng)相:含0.07%冰醋酸的3%甲醇溶液;流速:1.0 ml/min;檢測波長:254 nm;柱溫:20℃;進(jìn)樣量20 μl。按次黃嘌呤峰計(jì)算,理論塔板數(shù)不低于3000。在實(shí)驗(yàn)條件下次黃嘌呤的保留時(shí)間為9.59 min,與相鄰未知峰的分離度>1.5。

    1.2.2 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取焙干鹿茸樣品1.0000 g,置于250 ml具塞錐形瓶中,加50%乙醇40 ml,放入60℃水溫的超聲波中提取40 min后,以12000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min,取上清液于100 ml容量瓶中,用50%乙醇定容,再用0.45 μm濾膜過濾,濾液待用。

    1.3 結(jié)果

    1.3.1 測定波長的選擇 取次黃嘌呤的50%乙醇溶液,經(jīng)紫外-可見分光光度計(jì)掃描,確定254 nm為檢測波長。

    1.3.2 HPLC流動(dòng)相的選擇 用冰醋酸含量不同的甲醇水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明0.07%冰醋酸的3%甲醇溶液作流動(dòng)相,樣品中的次黃嘌呤能得到較好分離。

    1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取5 mg次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品,置于50 ml量瓶中,加水定容至刻度,混勻。濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。取儲備液配制 1.0、2.0、5.0、10、15、20、25、30 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液,按(2.2.1)色譜條件進(jìn)行測定,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。次黃嘌呤在1~30 mg/L濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系,回歸方程y=68.749x-8.0225,R2=0.9997。

    1.3.4 超聲輔助提取條件的優(yōu)化 試劑濃度、試劑體積、超聲時(shí)間、超聲溫度是影響超聲輔助提取的主要因素。本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇試劑濃度A分別為40%、50%和60%,試劑體積B(g:ml)分別為1∶20、1∶30和 1∶40,超聲時(shí)間 C 分別為 30 min、40 min和50 min,超聲溫度 D 分別為 40℃、50℃和 60℃為待考察的4種因素和3個(gè)水平,選用L9(34)正交表,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    根據(jù)對正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的考察和方差分析表明,各影響因素對焙干鹿茸中次黃嘌呤提取效果的影響順序?yàn)锳>C>B>D。焙干鹿茸中次黃嘌呤的最佳提取工藝為A2B3C3D2,即用40 ml50%乙醇60℃提取40 min,焙干鹿茸中次黃嘌呤的提取量最高。

    1.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 在(2.2.1)色譜條件下,將2 mg/L次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣20 μL,測定結(jié)果RSD=2.6%(n=6),表明本法具有一定的精密性,選定的色譜條件穩(wěn)定。

    1.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取鹿茸樣品1.0000 g,按(2.2.2)對樣品進(jìn)行前處理,每隔2 h取20 μL進(jìn)樣,12 h內(nèi)計(jì)算次黃嘌呤的含量變化,RSD <2.3%,提取液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

    1.3.7 回收率實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量焙干鹿茸樣品(n=3),分別加入低、中、高三種濃度的次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品,按(2.2.2)對樣品進(jìn)行前處理,(2.2.1)色譜條件進(jìn)行測定,計(jì)算回收率,結(jié)果表明平均加標(biāo)回收率在97.5% ~102.9%間。

    1.3.8 樣品測定 準(zhǔn)確稱取兩種不同批次的焙干鹿茸樣品1.0000 g按最佳實(shí)驗(yàn)條件提取和測定,結(jié)果兩種不同批次鹿茸樣品(n=3)中次黃嘌呤的含量分別為0.845 mg/g和1.074 mg/g。

    2 討論

    本文建立的超聲輔助提取、反相高效液相色譜測定焙干鹿茸樣品中次黃嘌呤的方法,具有良好的精密度和重現(xiàn)性,而且簡便快速,對設(shè)備要求低,可用于焙干鹿茸藥材中次黃嘌呤測定,且具有較好的實(shí)操性,能為鹿茸藥材的質(zhì)量評價(jià)提供可靠的測定方法和參考依據(jù)。

    [1]國家藥典委員會(huì).中國藥典.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:264-265.

    [2]王本祥,陳曉光.次黃嘌呤對單胺氧化酶的抑制作用.藥學(xué)學(xué)報(bào),1989,24(8):573.

    [3]楊秀偉.花鹿茸、馬鹿茸堿基成分的HPLC定量分析和其MAO活性抑制作用.中草藥,1995,26(1):17.

    [4]周冉,李淑芬.RP-HPLC同時(shí)快速測定鹿茸藥材中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷含量.藥物分析雜志,2009,29(4):575-578.

    [5]阮婧華.毛細(xì)管區(qū)帶電泳法同時(shí)測定冬蟲夏草中多種核苷及其堿基的含量.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,19(2)∶112.

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