D2-40在腫瘤淋巴管標(biāo)記研究應(yīng)用新進(jìn)展

唐 振（綜述）禹正楊（審校）

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，湖南 衡陽(yáng)421001）

目前惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的重要疾病，然而治療惡性腫瘤的難點(diǎn)就是腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，血道及淋巴道轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最主要的轉(zhuǎn)移途徑和復(fù)發(fā)的根源[1]。因此惡性腫瘤的血道和淋巴道轉(zhuǎn)移與患者的預(yù)后密切相關(guān)。目前對(duì)各種腫瘤的生物學(xué)行為的研究也常涉及腫瘤淋巴管、血管生成及其與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。盡管早在1863年Krause等發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)存在新生的淋巴管，但人類(lèi)對(duì)淋巴系統(tǒng)的研究遠(yuǎn)沒(méi)有血管系統(tǒng)研究的深入，造成這種現(xiàn)象的主要原因是缺乏有效的鑒定淋巴管的特異性的標(biāo)志物[2]。由于常規(guī)HE染色中，區(qū)別淋巴管和血管非常困難，不可避免地存在主觀性，找到一種特異性和敏感性都高的淋巴管標(biāo)志物，對(duì)惡性腫瘤組織中淋巴管和血管的研究顯得尤為重要。

近來(lái)區(qū)分淋巴管和血管的方法取得了積極進(jìn)展，一些淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異標(biāo)志物被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，如酶組織化學(xué)染色5’核苷酸酶（5’Nase）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-3（VEGFR-3）、淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1（ LYVE-1）和腎小球足突細(xì)胞黏蛋白（ Podoplanin）、D2-40等，但標(biāo)記淋巴管的5’核苷酸酶以及VEGFR-3、LYVE-1、Podoplanin等抗體都存在許多不足之處。D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的最特異性、最好的惡性腫瘤淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物[3]，其特異性明顯高于目前常用的淋巴管標(biāo)志物VEGFR-3等[4]。

目前對(duì)D2-40的研究是淋巴管標(biāo)志物領(lǐng)域的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，D2-40對(duì)研究惡性腫瘤的淋巴管生成機(jī)制、淋巴管浸潤(rùn)擴(kuò)散以及通過(guò)靶向治療抑制腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移等有著積極意義。本人就D2-40在病理診斷中的應(yīng)用進(jìn)展作相關(guān)綜述。

D2-40的結(jié)構(gòu)特征及重要生理功能：D2-40分子是Marks等[5]于1999年在研究生殖細(xì)胞腫瘤和胚胎睪丸的精母細(xì)胞表面新發(fā)現(xiàn)的一種唾液酸粘蛋白，其mRNA翻譯的蛋白質(zhì)分子由 166個(gè)氨基酸構(gòu)成，質(zhì)量為43kD，是最新發(fā)現(xiàn)特異性標(biāo)記淋巴管的鼠來(lái)源IgG1單克隆抗體。最近國(guó)外通過(guò)在人類(lèi)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上進(jìn)行Western blotting、ELISA及siRNA介導(dǎo)的podoplanin基因敲除等方法，發(fā)現(xiàn)D2-40抗體能通過(guò)唾液酸蛋白特異性結(jié)合、檢測(cè)腫瘤淋巴管內(nèi)皮上固定的抗原決定簇，即跨膜糖蛋白podoplanin FC片斷，其敏感度和特異性均都高于其他淋巴管內(nèi)皮的分子標(biāo)志物[6]。

最新的研究發(fā)現(xiàn)D2-40可用來(lái)標(biāo)識(shí)多種腫瘤的新生微淋巴管內(nèi)皮上有固定的抗原決定簇，該抗原決定簇在有管壁平滑肌的成熟淋巴管和血管內(nèi)皮上沒(méi)有表達(dá)[7]。甄樂(lè)鋒[4]等用D2-40進(jìn)行免疫組化染色標(biāo)記組織淋巴管時(shí)發(fā)現(xiàn)其僅在被覆單層內(nèi)皮細(xì)胞的小淋巴管如終末淋巴管顯色，它既不能使有周細(xì)胞/平滑肌的大淋巴管顯色，也不能使淋巴結(jié)內(nèi)的高內(nèi)皮靜脈顯色。D2-40還可在淋巴結(jié)的淋巴竇周壁細(xì)胞膜上以及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞間隙表達(dá)[8]。超微結(jié)構(gòu)研究也表明D2-40主要表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的腔面，少部分表達(dá)于非腔面和細(xì)胞間質(zhì)[6]。

研究發(fā)現(xiàn)D2-40作為淋巴管標(biāo)志物，不僅能是應(yīng)用于冷凍切片，且能較好地應(yīng)用于經(jīng)福爾馬林處理后石蠟包埋的組織切片，其使用方法更簡(jiǎn)便，使用范圍也更廣泛[9]。D2- 40免疫組化染色判斷淋巴管浸潤(rùn)的陽(yáng)性率明顯高于HE染色，并可以避免由于標(biāo)本固定導(dǎo)致組織收縮而造成的假性淋巴管浸潤(rùn)。D2-40與血管特異性標(biāo)志物CD31、CD34等在惡性腫瘤中的雙重免疫組織化學(xué)染色中無(wú)交叉反應(yīng)，可以用于腫瘤血管、淋巴管內(nèi)皮同時(shí)染色[10-12]。

目前常見(jiàn)的幾種淋巴管標(biāo)志物及其特點(diǎn)：最初采用酶組織化學(xué)染色法鑒別淋巴管和血管，5’核苷酸酶堿性磷酸酶（5’Nase-Aplases）雙重染色法。 5’-Nase染色很容易受實(shí)驗(yàn)條件的影響及各種酶之間交叉反應(yīng)的存在，染色后背景較深， 而且只適用于新鮮標(biāo)本。最近有報(bào)道Alpase也可在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。該法在淋巴管內(nèi)皮染色中的應(yīng)用受到一定的限制。

VEGFR-3是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物，VEGFR-3屬于酪氨酸激酶受體家族，它也是最先發(fā)現(xiàn)的淋巴管特異性調(diào)控受體，主要表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的腔膜面[13]。除表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，其也表達(dá)于某些新生血管內(nèi)皮，所以單獨(dú)應(yīng)用VEGFR-3鑒別淋巴管和血管的特異性不高。

LYVE-1是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的對(duì)淋巴管特異的透明質(zhì)酸受體，是CD44糖蛋白的同系化合物，其均勻分布于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的基底面和胞膜管腔面。研究表明其特異地表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，也在肝、脾竇隙狀血管和胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層有表達(dá)。最近研究顯示腫瘤內(nèi)約有10%的LYVE-l陽(yáng)性脈管是血管[14]。

另一個(gè)淋巴管內(nèi)皮特異標(biāo)志物是Porx-1，其是同源異型盒轉(zhuǎn)錄因子基因產(chǎn)物，與胚胎淋巴管芽的生長(zhǎng)、延伸及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的表型改變密切相關(guān)，是淋巴管生成過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用。 Por-x1在內(nèi)皮細(xì)胞中僅特異性地表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，但還可表達(dá)于多種類(lèi)型的非內(nèi)皮細(xì)胞，Prox-1尚還不能獨(dú)立標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮，須與 LYVE-1等聯(lián)合使用才可確定淋巴管特異性。

腎小球足突細(xì)胞黏蛋白（podoplanin）是目前一種新的淋巴管內(nèi)皮特異標(biāo)志物。目前除了在皮膚某些血管內(nèi)皮發(fā)現(xiàn)其表達(dá)外，尚未見(jiàn)其表達(dá)于其他組織微血管的報(bào)道。雖然podoplanin非常廣泛地用作淋巴內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴管生成的特異性標(biāo)志物，但是與D2-40比較，后者有如下優(yōu)越性：①D2-40是單克隆抗體，而podoplanin 是多克隆抗體；②D2-40不需要特殊處理，可以直接使用，而podoplanin需要作前期親和力純化而使用硝基纖維素分解封閉重組體蛋白; ③在進(jìn)行免疫組化過(guò)程中，D2-40石蠟組織切片不需要熱修復(fù)抗原決定簇，而podoplanin需要進(jìn)行熱修復(fù)。另外還有學(xué)者認(rèn)為D2-40與podoplanin抗體相比，有更高的敏感性，而其特異性可高達(dá)98.8%[15]。D2-40抗體還能特異性地識(shí)別podoplanin。

D2-40在臨床病理中的應(yīng)用：D2-40在許多正常細(xì)胞表面也有表達(dá)，如淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞、間皮細(xì)胞、消化道cajal細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞、基底細(xì)胞；D2-40在某些腫瘤中也呈陽(yáng)性表達(dá)，包括肌成纖維細(xì)胞瘤、胃腸道間質(zhì)瘤、間皮瘤、精原細(xì)胞瘤、某些腦腫瘤（顱咽管瘤，腦脊膜瘤等）等[16]。D2-40在人乳腺、胃、結(jié)腸、黑色素瘤、前列腺的癌細(xì)胞上則沒(méi)有表達(dá)[3]。D2-40可用于識(shí)別正常組織和乳腺癌、胃癌、黑色素瘤、前列腺癌等多種惡性腫瘤的新生微淋巴管，檢測(cè)原發(fā)腫瘤淋巴管密度、淋巴管浸潤(rùn)以及淋巴道轉(zhuǎn)移。D2-40對(duì)腫瘤診斷和鑒別診斷以及判斷惡性腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展、預(yù)后具有重要意義，已開(kāi)始廣泛應(yīng)用于腫瘤淋巴管與腫瘤生物學(xué)行為關(guān)系的研究。

文獻(xiàn)報(bào)道D2-40在胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、口腔癌等腫瘤中D2-40表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移、PTNM分期密切相關(guān)，與患者性別、年齡無(wú)關(guān)。腫塊越大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度越低、浸潤(rùn)深度越深、轉(zhuǎn)移器官越多、PTNM分期越晚，淋巴管密度越大[17-18]。D2-40標(biāo)記的惡性腫瘤淋巴管具有異質(zhì)性，表現(xiàn)為不同區(qū)域的淋巴管管腔形狀大小不一和淋巴管密度不均。癌組織周邊區(qū)淋巴管數(shù)量明顯增多，淋巴管呈擴(kuò)張狀不規(guī)則形，癌組織中淋巴管主要位于癌組織周邊區(qū)，淋巴管豐富，擴(kuò)張與閉鎖的淋巴管并存，以擴(kuò)張的為主，且管壁很薄，內(nèi)皮細(xì)胞間有較寬的縫隙，而在腫瘤中心區(qū)淋巴管數(shù)量較腫瘤周?chē)黠@減少，淋巴管多呈閉塞條索狀。癌組織周邊的淋巴管的異?？赡芘c腫瘤具有侵襲傾向高、分化程度較差及易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征有關(guān)。

D2-40標(biāo)記淋巴管測(cè)定淋巴管密度，可以作為評(píng)估腫瘤良惡性及轉(zhuǎn)移狀況的一項(xiàng)輔助指標(biāo)，具有良好的臨床病理應(yīng)用價(jià)值，為確定臨床治療方案提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。D2-40標(biāo)記的乳腺淋巴管時(shí)乳腺良性病變及乳腺癌組織均可見(jiàn) D2-40的表達(dá)，但微淋巴管密度在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組明顯高于乳腺良性病變組，可能為判斷乳腺病變良惡性的指標(biāo)[19]。Pearson相關(guān)性分析顯示乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中微淋巴管密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期呈正相關(guān)[20]，而與ER、PR 、Her-2表達(dá)無(wú)關(guān)[4]。D2-40標(biāo)記的微淋巴管密度在宮頸鱗癌中的表達(dá)明顯高于正常宮頸組織及CIN組織， 且D2-40能夠比較客觀的反應(yīng)早期宮頸鱗癌和癌前病變中的淋巴管新生情況[14]。Longatto-Filho[21]研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌的淋巴管新生始于癌前病變。淋巴管密度也能成為判斷子宮內(nèi)膜腺癌早期淋巴管轉(zhuǎn)移的一個(gè)指標(biāo)[22]。保麗玲[8]等對(duì)胃癌中淋巴管密度的檢測(cè)時(shí)，經(jīng) D2-40染色證實(shí)的腫瘤淋巴管浸潤(rùn)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系進(jìn)行分析顯示，其與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Lauren分型和Ming分型密切相關(guān)。淋巴管浸潤(rùn)檢測(cè)還可為早期癌癥的手術(shù)方式提供參考，即D2-40染色呈淋巴管浸潤(rùn)陰性，可避免對(duì)這些患者行根治性手術(shù)[23]。此外，D2-40標(biāo)記間皮細(xì)胞的特異度較高，可用于惡性間皮瘤與轉(zhuǎn)移性腺癌漿膜腔積液的鑒別[24]。D2-40還是乳腺肌上皮細(xì)胞的一個(gè)新的標(biāo)志物[25]。

腫瘤細(xì)胞侵襲淋巴管形成淋巴道轉(zhuǎn)移程是一系列復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，其間有多個(gè)癌基因激活、大量的細(xì)胞因子及分子通路的介導(dǎo)，目前的許多機(jī)制都處于探索階段。目前所知癌細(xì)胞經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移過(guò)程中淋巴管生成是腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的重要步驟。惡性腫瘤細(xì)胞，尤其是分化較差及浸潤(rùn)程度較高的惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)周?chē)M織具有較強(qiáng)的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移能力，容易發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移。

D2-40在判斷腫瘤淋巴管分布和腫瘤轉(zhuǎn)移方面具重要作用，但在惡性腫瘤淋巴管生物學(xué)行為的研究中，我們必須認(rèn)識(shí)到目前各種淋巴管標(biāo)志物僅具有相對(duì)的特異性。目前對(duì)腫瘤淋巴管的認(rèn)識(shí)還在不斷完善中，隨著淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的提高，以及微轉(zhuǎn)移檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，更特異、更靈敏的新生淋巴管檢測(cè)標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤淋巴管生成、淋巴道轉(zhuǎn)移的機(jī)制必將得到進(jìn)一步闡明，將有助于進(jìn)一步了淋巴管在腫瘤生物學(xué)中的作用，并為惡性腫瘤在淋巴管生成、淋巴道轉(zhuǎn)移過(guò)程的靶向治療另辟蹊徑。

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