吡格列酮對(duì)缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致凋亡途徑的影響

姜秀萍，陳還珍，祖玉剛，杜西振

心肌缺血-再灌注損傷 （myocardial ischemia-reperfusion injury MIRI）是阻礙缺血心肌從再灌注療法中獲得最佳療效的主要難題，無論是溶栓、介入，還是外科搭橋、心臟移植手術(shù)。I／R時(shí)心肌細(xì)胞死亡既有壞死也有凋亡，且凋亡是決定梗死面積大小的主要因素，尤其在I／R早期心肌細(xì)胞凋亡（MA）作用更為明顯［1］。目前研究認(rèn)為調(diào)控細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有3條，分別是線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）通路。ERS

介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡反應(yīng)是近年發(fā)現(xiàn)并逐漸引起重視的致細(xì)胞凋亡重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)噻唑烷二酮類（thiazolidinediones，TZDs）胰島素增敏劑為過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）的高親和配體，可減輕MIRI時(shí)心肌梗死面積，改善心功能，起抗MIRI作用，主要機(jī)制是減輕再灌注時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡［2］。本文觀察吡格列酮對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的影響，探討吡格列酮在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑對(duì)心肌的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 健康Wistar雄性大鼠（山西醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)中心提供）30只，體重180g～220g，隨機(jī)分為3組，I／R+Pio組，灌服吡格列酮5mg／（kg·d），溶于2mL生理鹽水中，共14d；I／R組及假手術(shù)組，灌服生理鹽水，2mL／d，共14d。

1.2 藥品與試劑 鹽酸吡格列酮片（艾可拓，日本武田藥品工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)），GRP-78、caspace-12蛋白一抗為兔抗大鼠多克隆抗體 （北京博奧森）；二抗為羊抗兔SABC免疫組化試劑盒、TUNEL檢測(cè)試劑盒（博士德公司）。

1.3 動(dòng)物模型制作 烏拉坦5mL／kg腹腔注射麻醉，氣管插管進(jìn)行呼吸機(jī)輔助呼吸（HX200動(dòng)物呼吸機(jī)，成都泰盟科技有限公司），呼吸頻率60次／min，潮氣量20mL／kg，吸呼比1∶2，四肢皮下插入針形電極描記心電圖，沿胸骨左緣第3、4肋間行縱向切口，剪斷肋骨，破胸膜、心包膜，在左冠狀動(dòng)脈前降支起始部2mm處，用6～0絲線穿過心肌淺層，將絲線兩端由一直徑為1mm的聚乙烯管中穿出，心跳穩(wěn)定15min后抽緊線，血管鉗推壓小管壓迫左前降支并與絲線一并夾住，阻斷冠脈血流，造成心肌缺血。30min后放松聚乙烯管和絲線，以造成再灌注損傷模型。以心電圖R波高聳或ST段抬高，局部心肌出現(xiàn)發(fā)紺為缺血形成。放松后抬高的ST段下降1／2以上為MIRI造模成功。假手術(shù)組只在左冠狀動(dòng)脈前降支下穿線，不結(jié)扎，余步驟同上。各組大鼠再灌注2h后處死，開胸，取左室前壁同一部位心肌組織，10%中性甲醛4℃固定24h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切成厚5μm切片。用于心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)及免疫組化分析。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 細(xì)胞凋亡指數(shù) 切片常規(guī)二甲苯脫蠟及梯度乙醇脫水后，嚴(yán)格按TUNEL試劑盒說明書操作。采用中型樹膠封片，光鏡下正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)綠色，凋亡細(xì)胞核呈深淺不一的棕褐色。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野中凋亡陽性心肌細(xì)胞核數(shù)目及其占總細(xì)胞核數(shù)目的比例，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.4.2 GRP78，caspase-12蛋白平均積分光密度 采用SABC法檢測(cè)GRP78和caspase-12蛋白表達(dá)，嚴(yán)格按試劑說明操作。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片鏡檢。鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)顯示棕黃色為GRP78和caspase-12蛋白表達(dá)陽性。顯微圖像采集系統(tǒng)對(duì)每張免疫組化切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），利用Image.Pro Plus5.0專業(yè)圖像分析軟件分析陽性的平均灰度值（0～255范圍內(nèi)，灰度值與染色強(qiáng)度成反比），求出平均積分光密度（average integrate optical density，AIOD）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，吡格列酮組為（23.2±3.4）%，缺血再灌注組為（34.5±4.9）%，假手術(shù)組為（1.6±0.4）%。吡格列酮組較缺血再灌注組低（P＜0．05），但高于假手術(shù)組（P＜0.05）。

2.2 GRP78蛋白平均積分光密度AIOD 吡格列酮組為0.44±0.03，缺血再灌注組為0.55±0.02，假手術(shù)組為0.02±0.02，吡格列酮組較缺血再灌注組低（P＜0．05），但高于假手術(shù)組（P＜0.05）。

2.3 Caspase-12蛋白平均積分光密度 吡格列酮組為0.54±0.03，缺血再灌注組為0.61±0.04，假手術(shù)組為0.01±0.01，吡格列酮組較缺血再灌注組低（P＜0．05），但高于假手術(shù)組（P＜0.05）。

3 討 論

I／R造成的心肌細(xì)胞損傷有壞死和凋亡兩種形式，且凋亡起著很大作用，是 MIRI重要機(jī)制之一［3］。在缺血心肌再灌注早期，細(xì)胞凋亡先發(fā)生于微冠脈的內(nèi)皮細(xì)胞，后呈放射狀使周圍的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，擴(kuò)大梗死范圍［4］。調(diào)控細(xì)胞凋亡的3條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，ERS對(duì)應(yīng)激細(xì)胞的損傷或凋亡有重要作用。ERS通過激活未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）以保護(hù)由ERS所引起的細(xì)胞損傷，恢復(fù)細(xì)胞功能，但是如果損傷太過嚴(yán)重，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定不能及時(shí)恢復(fù)，ERS則引起細(xì)胞凋亡。

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-78（GRP78），又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（Bip），屬于HSP70家族，可以結(jié)合未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)，促進(jìn)新生蛋白質(zhì)的正確折疊，防止未折疊、錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的聚集。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，GRP78的表達(dá)上調(diào)非常明顯，因而GRP7的誘導(dǎo)表達(dá)被廣泛用于ERS和UPR激活的標(biāo)志［5］。Zhang等［6］用 ERS誘導(dǎo)劑 TM 處理心肌細(xì)胞，引起GRP78mRNA及蛋白水平明顯升高，且這一處理可明顯減輕ATP耗竭及氧化應(yīng)激造成的心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）的釋放，增加ER對(duì)Ca2+的攝取，提示ERS可通過誘導(dǎo)ER伴侶蛋白的表達(dá)增強(qiáng)心肌細(xì)胞抵抗I／R損傷的能力。ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有3個(gè)主要途徑：CHOP通路、JNK通路、caspases通路。caspase-12定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜，是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的關(guān)鍵分子。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)caspase-12缺陷鼠能抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡，而對(duì)其他死亡刺激仍可發(fā)生細(xì)胞凋亡，表明caspase-12與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡的機(jī)制有關(guān)，而與非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡無關(guān)［7］。缺血預(yù)處理（isehemia preconditioning，IPC）是減輕I／R損傷的最有效方法之一，可縮小梗死范圍，改善心臟功能，減少心律失常等。且預(yù)處理可明顯減少凋亡細(xì)胞，預(yù)處理在一定程度上通過減少心肌細(xì)胞凋亡而減輕I／R［8］。各種不同的PPARγ激動(dòng)劑TZDs都可以減少 MIRI，發(fā)揮類似IPC作用。但以往實(shí)驗(yàn)多為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑的CHOP通路，JNK通路，關(guān)于吡咯列酮在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)caspases通路的實(shí)驗(yàn)還鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑經(jīng)典標(biāo)志物GRP-78、caspase-12的蛋白檢測(cè)，結(jié)果顯示，吡咯列酮預(yù)處理后細(xì)胞凋亡指數(shù)及caspase-12、GRP-78表達(dá)均較I／R時(shí)表達(dá)有所減輕，提示吡格列酮產(chǎn)生的心肌保護(hù)作用與ERS有關(guān)，可通過抑制I／R導(dǎo)致的過度ERS，下調(diào)GRP78、caspase-12表達(dá)水平，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。為臨床更好應(yīng)用吡格列酮提供理論基礎(chǔ)。但該實(shí)驗(yàn)存在一些缺陷，研究只是取I／R后2h時(shí)間點(diǎn)觀察吡格列酮預(yù)處理對(duì)caspase-12、GRP-78蛋白水平的影響 ，其他時(shí)間點(diǎn)及不同劑量研究尚待進(jìn)一步完善。

［1］ Palojoki E，Saraste A，Eriksson A，et al.Cardiomyocyte apoptosis and ventricular remodeling after myocardial infarction in rats［J］.Am J Physiol Heart Cire Physiol，2001，280：H2726-H2731.

［2］ Cao ZL，Ye P，Long CL，et al.Effect of pioglitazone，aper oxisome proliferat or-activated receptorγagonist，on ischemia reperfusion injury in rats［J］.Pharmacology，2007，79：184-192.

［3］ Soloviev A，Stefanov A，Parslukov A，et al.Arrthythmogenic peroxynitrite induced alterations in mammalian heart contractility and its prevention with quercetin-filled liposomes［J］.Cardiovasc Toxieol，2002，2（2）：129-139.

［4］ Scarabelli T，Stephanou A，Rayment N，et al.Apoptosis of endothelial cells precedes myocyte cell apoptosis in ischemiaⅡreperfusion injury［J］.Circulation，2001，104 （3）：253-256.

［5］ 張海燕，劉寶琴，鄧娓娓，等.GRP78在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡中的作用［J］.中華腫瘤防治雜志，2009，16（18）：1379-1382.

［6］ Zhang PL，Lun M，Teng J，et al.Preinduced molecular chaper ones in the endoplasmic reticulum protect cardiomyocytes from lethal injury［J］.Ann Clin Lab Sci，2004，34（4）：4492-457.

［7］ Nakagawa T，Zhu H，Morishima N，et al.Caspase-12mediates ER-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-β［J］.Nature，2000，403（6765）：98-103.

［8］ 張向鑫，李慶浩，李清.細(xì)胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷的關(guān)系［J］.泰山衛(wèi)生，2004，28：3-7.