自體干細(xì)胞移植規(guī)范化治療下肢慢性缺血性疾病的專(zhuān)家共識(shí)

中華醫(yī)學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)工程學(xué)分會(huì)干細(xì)胞工程專(zhuān)業(yè)委員會(huì)

中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)血管外科學(xué)組

一、概述

下肢缺血是一種常見(jiàn)癥狀。在我國(guó)造成下肢缺血的主要病因是動(dòng)脈粥樣硬化閉塞癥、血栓閉塞性脈管炎和糖尿病足等。下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的發(fā)病率10﹪。隨著年齡的增長(zhǎng)，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，70歲以上人群的發(fā)病率在15﹪～20﹪。下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的預(yù)后較差，其中間歇性跛行患者5年病死率30﹪，而靜息痛、潰瘍和壞疽的下肢缺血患者5年病死率達(dá)70﹪，主要死亡原因是冠心病和腦血管疾病。下肢缺血的主要臨床表現(xiàn)為下肢涼、麻木、無(wú)力、間歇性跛行、靜息痛和肢體缺血性潰瘍、壞疽等。國(guó)內(nèi)外臨床常用的分期方法有Fontaine法和Rutherford法。下肢缺血的治療目的是增加行走的距離，緩解疼痛，促進(jìn)潰瘍愈合和避免截肢。血管重建是治療重癥下肢缺血的最佳方案，但要根據(jù)患者的臨床癥狀和全身情況選擇。主要治療方法包括藥物治療、血管腔內(nèi)治療、手術(shù)治療以及干細(xì)胞移植和基因治療等。由于對(duì)全身情況和血管條件的限制，動(dòng)脈旁路手術(shù)和血管腔內(nèi)成形術(shù)(球囊擴(kuò)張、支架植入)適用于多數(shù)有條件的患者。對(duì)于不適合上述治療及上述治療效果不佳或術(shù)后復(fù)發(fā)者，尤其是糖尿病下肢缺血和血栓閉塞性脈管炎患者，病變多累及下肢遠(yuǎn)端小動(dòng)脈，缺乏安全和有效的治療方法，這部分患者面臨截肢的危險(xiǎn)，甚至危及生命。自體干細(xì)胞移植作為近年來(lái)血管再生的新技術(shù)，為這部分患者提供了一種新的治療選擇。

自體干細(xì)胞移植治療下肢缺血的主要目標(biāo)是促進(jìn)下肢血管新生。其中起主要作用的是能形成血管的成體干細(xì)胞（包括血管內(nèi)皮祖細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞等）。正常情況這些干細(xì)胞主要存在于骨髓中，外周血液循環(huán)中很少。當(dāng)存在肢體缺血時(shí)，這些干細(xì)胞將動(dòng)員到外周血中，歸巢到缺血組織，發(fā)揮血管新生的作用。通過(guò)藥物進(jìn)行骨髓動(dòng)員刺激后這些干細(xì)胞也可以被動(dòng)員到外周血液循環(huán)中。

目前研究認(rèn)為，骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的CD34陽(yáng)性細(xì)胞是內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC）的主要來(lái)源，CD34(造血干細(xì)胞及EPC的共有表面標(biāo)記物)細(xì)胞在末梢血中只有骨髓的0.2﹪?？蓽y(cè)定的最幼稚細(xì)胞在1 ml末梢血中僅有2.9個(gè)，為骨髓的1﹪。提示骨髓細(xì)胞有可能提供更多的EPC用于血管新生療法。成年個(gè)體的骨髓單個(gè)核細(xì)胞（bone marrow mononuclear cell，BM-MNC)中含有多種干細(xì)胞成分，其中CD34陽(yáng)性細(xì)胞含量約占BM-MNC總數(shù)的3﹪，為外周血的15倍，同時(shí)BM-MNC移植還可以提供多種促血管生長(zhǎng)因子，故BM-MNC移植兼具EPC和細(xì)胞生長(zhǎng)因子的作用。在高齡、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化等病理狀態(tài)下，患者EPC的數(shù)量、增殖潛能、黏附和成血管能力均降低，說(shuō)明這些患者自發(fā)的血管新生潛能降低，進(jìn)一步支持了對(duì)這些患者進(jìn)行干細(xì)胞移植的必要性。

根據(jù)干細(xì)胞的不同來(lái)源，目前臨床上自體干細(xì)胞移植治療慢性下肢缺血的方式分3種：即自體骨髓干細(xì)胞移植、自體外周血干細(xì)胞移植和改良的自體骨髓干細(xì)胞移植（即骨髓動(dòng)員后的自體骨髓干細(xì)胞移植）。

自體干細(xì)胞移植至少有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1）不存在異體干細(xì)胞的免疫排斥；（2）沒(méi)有胚胎干細(xì)胞的倫理道德問(wèn)題；（3）作為自體的細(xì)胞，僅僅是采用富集提純的辦法，沒(méi)有在體外進(jìn)行誘導(dǎo)分化和增殖，也不存在異種血清污染和基因突變等風(fēng)險(xiǎn)；（4）在嚴(yán)格無(wú)菌下操作，體外分離時(shí)間短（2 h），微生物污染的可能性??；（5）正如患者本身的植皮一樣，都是患者本身的組織，具有取材方便的特點(diǎn)；（6）自體干細(xì)胞移植治療血液疾病已有幾十年的歷史。因此，目前自體干細(xì)胞移植治療肢體缺血性疾病呈現(xiàn)出廣闊的前景。

二、自體干細(xì)胞移植的方法

（一）自體骨髓干細(xì)胞移植

先局麻下抽取患者的骨髓血，然后將抽取的骨髓血在干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室分離純化得到BM-MNC，再通過(guò)肌注或動(dòng)脈內(nèi)注射的方式進(jìn)行缺血肢體的移植。在單純骨髓干細(xì)胞移植中，骨髓血的抽取量一般在400～500 ml，得到的BM-MNC總數(shù)在（1～3）×109個(gè)。由于患者大多年齡比較大，體弱并多伴有糖尿病、高血壓、冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病或/和腦動(dòng)脈硬化癥等，如果1次抽取過(guò)多的骨髓血，會(huì)增加心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生。可通過(guò)同時(shí)輸血或減少采髓量的辦法來(lái)克服這一缺點(diǎn)。

（二）自體外周血干細(xì)胞移植

先采用骨髓動(dòng)員的方法[皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF) 5～7 d]將骨髓中的干細(xì)胞動(dòng)員到外周血液循環(huán)中，通過(guò)專(zhuān)用的單個(gè)核細(xì)胞分離機(jī)，將含有造血干細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞分離出來(lái)，然后再移植到患者本人的缺血局部（通過(guò)缺血局部肌肉注射或者通過(guò)動(dòng)脈腔內(nèi)注射），從而達(dá)到促進(jìn)血管新生，緩解肢體缺血的目的?；颊卟粫?huì)失血，而一次得到的單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)一般可達(dá)1010量級(jí)。缺點(diǎn)是長(zhǎng)時(shí)間的骨髓動(dòng)員會(huì)使大量有核細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)，導(dǎo)致血液黏稠度增加，血管內(nèi)血栓形成的機(jī)會(huì)增加，增加心肌梗死和腦梗塞發(fā)生的危險(xiǎn)。因此，在骨髓動(dòng)員早期就應(yīng)采用正規(guī)的抗凝措施，在整個(gè)過(guò)程中需要注意心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生。

（三）改良的骨髓干細(xì)胞移植

為避免在單純骨髓干細(xì)胞移植中抽取骨髓血量過(guò)多的問(wèn)題，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院谷涌泉等發(fā)明了改良的骨髓干細(xì)胞移植方法。即骨髓動(dòng)員刺激以后的骨髓干細(xì)胞移植。主要步驟是在抽取骨髓前先使用G-CSF短期動(dòng)員骨髓（2～3 d），在大量增殖的干細(xì)胞仍在骨髓中未進(jìn)入外周血之前，抽取骨髓血200 ml，在干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室分離純化BM-MNC后再進(jìn)行移植。從臨床研究的資料中發(fā)現(xiàn)：無(wú)論是主觀評(píng)價(jià)指標(biāo)，還是客觀評(píng)價(jià)指標(biāo)均比單純的骨髓干細(xì)胞移植和外周血干細(xì)胞移植的療效更好，而且不良反應(yīng)也較外周血干細(xì)胞少。與前2種方式相比較，此方式的主要優(yōu)點(diǎn)是：（1）抽取骨髓血量少（200 ml），對(duì)患者全身影響不大；（2）動(dòng)員時(shí)間短，外周血液中單個(gè)核細(xì)胞的數(shù)量不高，血液黏稠度比外周血干細(xì)胞低，發(fā)生心腦血管意外的幾率較小；（3）可以獲得大量的骨髓干細(xì)胞。

三、臨床應(yīng)用

（一）實(shí)施條件

1.技術(shù)準(zhǔn)入：盡管是自體干細(xì)胞移植，沒(méi)有異體干細(xì)胞的免疫排斥，也不存在胚胎干細(xì)胞的倫理道德問(wèn)題，但是專(zhuān)家們一致認(rèn)為，要有醫(yī)院的醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)和新技術(shù)委員會(huì)或相關(guān)部門(mén)的批準(zhǔn)。

2.人員資質(zhì)準(zhǔn)入：（1）專(zhuān)業(yè)人員需經(jīng)過(guò)相關(guān)的業(yè)務(wù)培訓(xùn)；（2）需要相關(guān)專(zhuān)業(yè)副主任醫(yī)師以上人員負(fù)責(zé)實(shí)施。

3.實(shí)驗(yàn)室設(shè)施和條件：（1）萬(wàn)級(jí)實(shí)驗(yàn)室；（2）離心機(jī)；（3）擬行外周血干細(xì)胞移植的單位要有血細(xì)胞分離機(jī)。

（二）患者的選擇

1.適應(yīng)證：（1）各種原因?qū)е碌穆韵轮毖约膊o(wú)法行手術(shù)搭橋或者介入治療，而保守治療無(wú)效者；（2）無(wú)法耐受旁路手術(shù)和介入治療的患者。

2.禁忌證：（1）過(guò)去5年內(nèi)明確有惡性疾病的患者或血中腫瘤標(biāo)記物（AFP，CEA，PSA，CA19-9，CA125）水平明顯升高者；（2）嚴(yán)重心、肺、肝、腎功能衰竭或一般狀況很差不能耐受干細(xì)胞移植手術(shù)者；（3）近期有心肌梗死或腦梗塞病史者禁忌；（4）主動(dòng)脈、髂動(dòng)脈等大動(dòng)脈閉塞者。

（三）自體干細(xì)胞移植的圍手術(shù)期處理

1.患者的思想準(zhǔn)備：詳細(xì)地向患者說(shuō)明干細(xì)胞移植方法及其優(yōu)點(diǎn)和不足之處，使患者有比較充分的準(zhǔn)備。特別要說(shuō)明干細(xì)胞的微創(chuàng)性，使患者消除顧慮，輕裝上陣。

2.患者的身體準(zhǔn)備：在取髓和移植部位要備皮。需要血管腔內(nèi)介入的患者，術(shù)前先行碘過(guò)敏試驗(yàn)，對(duì)糖尿病與腎功能不全、脫水患者術(shù)前開(kāi)始水化，糖尿病患者術(shù)前停用二甲雙胍。有感染的患者合理選用抗生素抗感染治療。

手術(shù)當(dāng)天要禁食水，靜脈輸液保證患者基本的需求量和營(yíng)養(yǎng)。如果術(shù)前血色素低于10 g/L，建議備血200 ml，在抽取骨髓血時(shí)緩慢輸血。

3.干細(xì)胞移植術(shù)前骨髓動(dòng)員：皮下注射G-CSF 5～10 μg / kg，1 次 /d，外周血干細(xì)胞移植動(dòng)員4～5d，改良骨髓干細(xì)胞移植動(dòng)員2～3d，每日監(jiān)測(cè)WBC不超過(guò)5萬(wàn)/μl，外周血干細(xì)胞移植最好待外周血CD34+細(xì)胞數(shù)達(dá)10～20個(gè)/μl再采集外周血干細(xì)胞。動(dòng)員開(kāi)始即應(yīng)給予抗凝和抗血小板治療，阿司匹林0.1 g，1次/d；低分子肝素0.4～0.6 ml，皮下注射，1次/12 h或普通肝素4000 u，皮下注射，1次/8 h?？鼓涂寡“逯委熤辽俪掷m(xù)至外周血白細(xì)胞恢復(fù)正常。

（四）實(shí)驗(yàn)室的處理（干細(xì)胞制備）

骨髓血的收取、轉(zhuǎn)送應(yīng)由專(zhuān)人負(fù)責(zé)，以免混淆。制備過(guò)程必須嚴(yán)格無(wú)菌操作，流程規(guī)范化，使用密度梯度離心法進(jìn)行分離制備，也可以選用不同型號(hào)的全自動(dòng)細(xì)胞分離系統(tǒng)，干細(xì)胞以生理鹽水稀釋至所需容量，制備的干細(xì)胞只能在4℃冰箱短時(shí)間保存，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，活力測(cè)定，有條件時(shí)推薦用流式細(xì)胞儀鑒定骨髓干細(xì)胞的成分。

（五）干細(xì)胞移植的方法、步驟和措施

一般移植方法有2種，分別為缺血肢體的局部肌肉注射移植和下肢動(dòng)脈腔內(nèi)注射移植。醫(yī)生可根據(jù)患者的全身情況和病變情況選擇適合的方法進(jìn)行移植。

1.局部缺血肌肉注射法：（1）麻醉多選用靜脈復(fù)合麻醉，也可選用硬膜外或者腰麻，由于注射范圍廣，次數(shù)多，局部麻醉不推薦；（2）抽取20～50 ml的生理鹽水稀釋制備好的干細(xì)胞懸濁液，然后抽取上述稀釋后的干細(xì)胞懸液備用；（3）在缺血肢體劃出要注射的具體位置，一般針距2 cm，每針注射0.75～1 ml；（4）注射后用酒精紗布消毒皮膚后包扎注射部位。

2.下肢動(dòng)脈腔內(nèi)注射：（1）一般選用局部麻醉，穿刺動(dòng)脈，放置動(dòng)脈鞘管，肝素抗凝；（2）用導(dǎo)絲和導(dǎo)管選擇到下肢病變動(dòng)脈，送入并充盈球囊，阻斷動(dòng)脈后將干細(xì)胞懸液緩慢推入動(dòng)脈腔內(nèi)，3～5 min完成，放松球囊并撤除；（3）退出動(dòng)脈鞘，壓迫并包扎穿刺點(diǎn)。

（六）干細(xì)胞移植術(shù)后的處理

1.術(shù)后根據(jù)需要應(yīng)用抗生素。

2.對(duì)于局部注射患者，術(shù)后2～3 d撤除包扎的紗布。

3.對(duì)于動(dòng)脈腔內(nèi)注射患者，一般術(shù)后需下肢制動(dòng)6 h，臥床24 h。術(shù)后建議用低分子肝素預(yù)防血栓形成。

（七）干細(xì)胞移植術(shù)后評(píng)價(jià)

1.安全性評(píng)價(jià)：干細(xì)胞移植的安全性問(wèn)題不容回避。對(duì)干細(xì)胞移植安全性的憂(yōu)慮主要是免疫排斥和腫瘤生長(zhǎng)的問(wèn)題。對(duì)于安全性的評(píng)價(jià)，必須注意下面幾點(diǎn)：是否有致瘤性，有無(wú)局部的不良反應(yīng)，包括局部有無(wú)紅、腫、熱、痛等炎癥反應(yīng)及過(guò)敏反應(yīng)，有無(wú)全身的不良反應(yīng)，術(shù)后肝腎等功能的變化。一旦出現(xiàn)嚴(yán)重不良事件應(yīng)按規(guī)定報(bào)告醫(yī)院相關(guān)主管部門(mén)。

2.有效性評(píng)價(jià)：臨床觀察有效性的主要指標(biāo)和方法主要包括主觀指標(biāo)和客觀指標(biāo)。其中主觀指標(biāo)包括以下幾點(diǎn)：疼痛、冷感和麻木等癥狀的改善程度。

（1）疼痛評(píng)分：標(biāo)準(zhǔn)為0分：無(wú)疼痛；1分：偶有疼痛，被問(wèn)及能回憶起；2分：疼痛經(jīng)常出現(xiàn)但能耐受，不需或偶用一般止痛劑；3分：經(jīng)常用一般止痛劑；4分：因疼痛影響睡眠，一般止痛藥劑難以緩解。

（2）冷感評(píng)分：標(biāo)準(zhǔn)為0分：無(wú)冷感；1分：患者偶述受累肢體有發(fā)涼、怕冷的感覺(jué)；2分：受累肢體經(jīng)常有發(fā)涼、怕冷的感覺(jué)；3分：受累肢體有明顯的冷、涼感覺(jué)，需要采用局部保溫措施，癥狀能得到一定程度的緩解；4分：受累肢體有明顯的冷、涼感覺(jué)，采用局部保溫措施，癥狀也無(wú)明顯改善。

（3）麻木評(píng)分：標(biāo)準(zhǔn)為0分：無(wú)麻木；1分：偶感輕度麻木；2分：經(jīng)常有輕度麻木不適；3分：麻木感覺(jué)明顯，但可以忍受；4分：麻木非常明顯，難以忍受，嚴(yán)重影響日常生活。

3.客觀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)主要包括：（1）間歇跛行的距離（干細(xì)胞移植前后跛行距離的變化）：主要測(cè)定無(wú)痛步行時(shí)間（分）或跛行距離（米），此項(xiàng)指標(biāo)帶有一定的主觀性，但是如果使用平板實(shí)驗(yàn)，則是一種非常簡(jiǎn)單和客觀的指標(biāo)；（2）皮膚的溫度差（雙下肢）：移植前后的變化；（3）經(jīng)皮氧分壓（TCPO2）：作為全球通用的3大評(píng)估血管疾病金標(biāo)準(zhǔn)之一，直接反映血管向組織供氧情況，可以對(duì)肢體缺血情況的定量評(píng)估，可以評(píng)估組織存活率，是一種無(wú)創(chuàng)，低成本并可重復(fù)使用的檢查方法，經(jīng)皮氧分壓測(cè)定，是一種比較客觀的指標(biāo)，國(guó)外經(jīng)常用此項(xiàng)檢查作為截肢與否和預(yù)測(cè)截肢平面，一般臨床上以20 mm Hg（1 mm Hg = 0.133 kPa）作為臨界值，不過(guò)受周?chē)h(huán)境影響較大，因此檢查前患者一定靜息平臥30 min以上，檢查室內(nèi)溫度要保持恒溫；（4）患肢紫紺及潰瘍的面積和深度（mm），壞疽范圍測(cè)量并標(biāo)記，作為客觀的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，能夠證明干細(xì)胞移植后是否有效。不過(guò)，即使血供得到了改善，潰瘍面的愈合仍需要一定的時(shí)間，尤其是較大潰瘍者，一般近期療效中僅適用于小潰瘍者；（5）靜息狀態(tài)下踝肱指數(shù)（ankle brachial index，ABI）及趾肱指數(shù)（toebrachial index，TBI）：是一種簡(jiǎn)單、方便和有效的客觀評(píng)價(jià)指標(biāo)，但是不少患者在短期內(nèi)不會(huì)明顯增加；（6）激光多普勒血流量的測(cè)定：作為一種評(píng)價(jià)下肢血供的金標(biāo)準(zhǔn)之一，具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，是一種非常好的無(wú)創(chuàng)檢查的評(píng)價(jià)指標(biāo)；（7）數(shù)字減影血管造影術(shù)（digital subtraction angiography，DSA）：觀察側(cè)支血管形成情況并評(píng)分。根據(jù)新生側(cè)支血管評(píng)估分4級(jí)：0級(jí)（無(wú)新生側(cè)支血管）、+1級(jí)（少許新生側(cè)支血管）、+2級(jí)（中量新生側(cè)支血管）和+3級(jí)（豐富新生側(cè)支血管）；（8）截肢率及截肢平面的變化：由于血管性截肢與血液供應(yīng)具有相關(guān)性，截肢平面經(jīng)常受到血液供應(yīng)的影響，如果移植前后的截肢平面有一定的變化，能夠達(dá)到降低截肢平面的目的，也能夠說(shuō)明干細(xì)胞移植的有效性。

（八）術(shù)后隨訪

推薦術(shù)后第1、3、6和12個(gè)月時(shí)各隨訪1次，第2年每半年隨訪1次。此后每年隨訪1次。

執(zhí)筆人：谷涌泉（首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院血管外科）

本專(zhuān)家共識(shí)由中華醫(yī)學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)工程學(xué)分會(huì)干細(xì)胞工程專(zhuān)業(yè)委員會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)血管外科學(xué)組頒布，歷時(shí)2年多時(shí)間，經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)（血管外科、內(nèi)分泌、干細(xì)胞研究等專(zhuān)業(yè)）汪忠鎬（院士）、吳祖澤（院士）、付小兵（院士）、曹誼林、韓忠朝、張傳森、辛世杰、李曉強(qiáng)、金畢、舒暢、胡何節(jié)、楊鏞、畢偉、高涌、周興立、郭連瑞、崔鳳琴、沈飛霞、趙湜、王富軍、王懷林、胡玲、黃文、呂曉霞、苗俊英、周慧敏、賈黎靜等50多名專(zhuān)家反復(fù)討論共同修改完成。