干、濕化學(xué)檢測系統(tǒng)測定腎功能高值標(biāo)本時稀釋液的選擇與評價

賀 勇，陳 嵌，唐治貴，劉容海，唐 佳，高中燕，米永華，袁作為

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院檢驗科 402160；2.重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院檢驗科 408400）

臨床生化檢驗工作中，經(jīng)常遇到被測項目的活力或濃度較高，超出測量線性范圍，需稀釋后再測。不同的方法、不同的測定項目以及不同的儀器對標(biāo)本稀釋液有不同的要求，不同稀釋液在不同的檢測系統(tǒng)中也會給測定結(jié)果帶來不同的影響［1］。目前全自動生化儀器均沒有配專用稀釋液，選用何種稀釋液既方便易得又不影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，各實驗室的做法不盡相同，也缺乏系統(tǒng)評價［2－4］。近年來，干化學(xué)檢測方法逐步推廣，尤其在急診和門診中應(yīng)用廣泛，雖然部分廠家可以提供專用稀釋液，但在實際臨床工作中很少使用，也未見系統(tǒng)評價的報道。另一方面，由于干、濕2個檢測系統(tǒng)的檢測原理完全不同，相同稀釋液在不同的系統(tǒng)中是否一致，目前也未見報道［5－6］。本實驗擬用不同稀釋液對腎功能3項——尿素 （Urea）、肌酐（Cr）、尿酸（UA），分別在干、濕2個檢測系統(tǒng)上的檢測結(jié)果進(jìn)行評價與比較，以期找到與系統(tǒng)和項目相適應(yīng)的理想稀釋液。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 高值標(biāo)本 收集本院患者新鮮血清，無明顯溶血及肉眼可見的黃疸和脂血。其值均接近但未超出該項目的線性范圍上限。

1.1.2 稀釋液 蒸餾水（DH2O）為本實驗室自制，阻抗值大于1.5MΩ；生理鹽水（NS）注射液為四川科倫藥業(yè)公司生產(chǎn)；7%小牛血清（7%BSA）用0.01mmol／L 磷酸緩沖夜（PBS）配制；混合血清均取自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院體檢人員新鮮血清，無明顯溶血、肉眼可見黃疸和脂血，其測定值均在參考區(qū)間內(nèi)，收集混勻離心，取上清備用。

1.1.3 儀器 美國強生Vitros350干化學(xué)全自動生化分析儀，日本日立7600－020全自動生化分析儀。

1.1.4 試劑 美國強生干化學(xué)檢測系統(tǒng)采用配套試劑，日立7600－020檢測系統(tǒng)采用四川邁克公司試劑。

1.2 方法 分別在強生干化學(xué)系統(tǒng)（簡稱干系統(tǒng)）和日立7600－020濕化學(xué)系統(tǒng)（簡稱濕系統(tǒng)）測定高值標(biāo)本和混合血清的 Urea、Cr和 UA原始值（Ap），將標(biāo)本用 DH2O、NS、BSA、混合血清4種稀釋液分別進(jìn)行1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32共5個系列的倍比稀釋。在干、濕系統(tǒng)上分別對各稀釋樣品進(jìn)行檢測，然后將實際測定結(jié)果（A1）與通過計算得到的理論值（T）進(jìn)行偏差計算及相關(guān)性分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理 在計算稀釋后標(biāo)本的理論值時，需考慮稀釋液的本底值（A0），本底值為稀釋液測定3次后的均值。稀釋后標(biāo)本的理論值計算公式如下:

相關(guān)性分析:以同一項目各稀釋系列的理論值為X，測定值為Y，擬合回歸方程。以r≥0.975作為相關(guān)性良好的判斷標(biāo)準(zhǔn)。所有數(shù)據(jù)分析均在Excel軟件上完成。

2 結(jié) 果

2.1 在儀器檢測范圍內(nèi)，分別在干、濕系統(tǒng)上測得DH2O、NS、7%BSA、混合血清的本底值見表1。

表1 稀釋液中Urea、Cr、UA的本底值

表2 在干、濕檢測系統(tǒng)上，各稀釋液的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

圖1 各稀釋液在干、濕化學(xué)系統(tǒng)Urea測定中的偏差比較圖

2.2 4種稀釋液在干、濕系統(tǒng)中不同項目檢測結(jié)果的偏差比較見圖1～3。

2.2.1 以美國CLIA′88總允許誤差的二分之一為判斷標(biāo)準(zhǔn)，Urea、Cr、UA偏差可接受范圍分別為:±4.5%、±7.5%、±8.5%。從圖1中可見，在濕系統(tǒng)中，Urea用NS、BSA、混合血清稀釋均符合要求，而用DH2O在較高稀釋倍數(shù)（＞1∶16）時不符合要求。在干系統(tǒng)中，Urea用NS和BSA稀釋超出了可接受范圍，DH2O和混合血清均符合要求，尤以混合血清稀釋偏差值最小。本實驗還發(fā)現(xiàn)Urea用NS和7%BSA稀釋后，在干、濕檢測系統(tǒng)中的偏差結(jié)果差異較大。

2.2.2 從圖2可見，濕化學(xué)系統(tǒng)中，Cr用DH2O、BSA、混合血清稀釋，測定結(jié)果均符合要求，而用NS稀釋，在較高稀釋倍數(shù)時就不符合要求。在干化學(xué)系統(tǒng)中，Cr除了BSA以外，各稀釋液均符合要求。從圖3可見在濕化學(xué)系統(tǒng)中，UA用DH2O、BSA、混合血清稀釋均符合要求，尤以混合血清稀釋，其測定結(jié)果偏差最小。在較高稀釋倍數(shù)時，用NS稀釋不符合要求。在干化學(xué)檢測系統(tǒng)中，在較高稀釋倍數(shù)（≥1∶16）時，UA用NS和BSA稀釋超出了可接受范圍，用DH2O和混合血清稀釋均符合要求，尤以混合血清稀釋，測定偏差最小。

圖2 各稀釋液在干、濕化學(xué)系統(tǒng)Cr測定中偏差比較圖

2.3 相關(guān)性分析 Urea、Cr及UA用不同的稀釋液進(jìn)行系列稀釋檢測后，分別對理論值與實測值進(jìn)行相關(guān)性分析，以實測值為Y，理論值為X擬合回歸方程，Y＝b＋a X。其回歸方程和相關(guān)系數(shù)平方見表2。

圖3 各稀釋液在干、濕化學(xué)系統(tǒng)UA測定中的偏差比較圖

3 討 論

在臨床常規(guī)生化檢測中，經(jīng)常會遇到超出檢測系統(tǒng)線性范圍的標(biāo)本，需要稀釋后復(fù)測，但究竟選用何種稀釋液，目前各實驗室做法并不相同［8－9］。同時干、濕系統(tǒng)檢測原理不同，干化學(xué)的理論基礎(chǔ)是Kubelka－Munk理論［10］，濕化學(xué)的理論基礎(chǔ)是Lamber－Beer定律，它們在檢測相同項目能否選用同一種稀釋液還有待證明［11］。

本次實驗選取用腎功能3項檢查的高值標(biāo)本以4種稀釋液稀釋后檢測發(fā)現(xiàn)，在濕化學(xué)檢測系統(tǒng)上，Urea用NS、BSA及混合血清均符合要求，而用DH2O稀釋在較高稀釋倍數(shù)（＞1∶16）時不符合要求，可能是DH2O對介質(zhì)影響較大，故測定偏差也較大。對Cr、UA用DH2O、BSA、混合血清均符合要求，而用NS在較高稀釋倍數(shù)時不符合要求，可能是因為NS的離子強度、pH值與低值血清相近，但無蛋白質(zhì)和血清成分，故測定結(jié)果偏差大。

在干化學(xué)檢測系統(tǒng)上，Urea、UA用DH2O和混合血清稀釋均符合要求，Cr除了BSA以外各稀釋液均符合要求。對于腎功能3項檢查的高值標(biāo)本，在濕化學(xué)系統(tǒng)中，均可用BSA和混合血清進(jìn)行稀釋；在干化學(xué)系統(tǒng)中，均可用DH2O和混合血清進(jìn)行稀釋。而同時能應(yīng)用于干、濕檢測系統(tǒng)的稀釋液只有正常人混合血清。可能因為低值血清的蛋白質(zhì)、離子強度、pH值和其他血清成分基本相近，因此其測定結(jié)果偏差最小［12］。

值得一提的是，在美國強生Vitros350干化學(xué)全自動生化分析儀Urea的試劑說明書上，寫明了如果標(biāo)本中尿素濃度超出系統(tǒng)的可報告范圍，可以用VITROS 7%牛血清清蛋白溶液稀釋樣本［13］。而在本實驗中Urea用7%BSA稀釋，其結(jié)果超出了可接受范圍。造成這種矛盾的原因，有待進(jìn)一步研究。

在線性驗證實驗中，根據(jù)分析測量范圍（AMR）評價要求（a＝1.00±0.05，r≥0.975或者r2≥0.95）［14－15］，在濕化學(xué)檢測系統(tǒng)中，Urea、Cr及UA，用4種稀釋液稀釋后AMR評價均符合要求，表明腎功能3項指標(biāo)在濕化學(xué)系統(tǒng)中檢測值與理論值相關(guān)性良好，符合臨床檢驗的要求。而在干化學(xué)檢測系統(tǒng)中，Urea以DH2O或混合血清稀釋后，AMR評價符合要求，而以NS或BSA均不符合要求；Cr只有NS和混合血清稀釋后，AMR評價符合要求，而DH2O和BSA均不符合要求；UA用4種稀釋液稀釋后AMR評價均符合要求，BSA稀釋液在Urea、Cr的檢測中均不符合要求，可能與BSA影響了參加反應(yīng)的酶的活性有關(guān)。

由偏差分析和線性評價可以看出，在濕化學(xué)檢測系統(tǒng)上，即使4種稀釋液均符合AMR評價要求，但是偏差分析仍有差異，應(yīng)引起重視。提示需同時進(jìn)行偏差分析和線性評價，才能得出科學(xué)的結(jié)論。

日常工作中，不同的檢測系統(tǒng)都會遇到樣本的結(jié)果超過檢測項目的線性范圍。本研究發(fā)現(xiàn)，在腎功能常規(guī)3項檢查超限時，同時能應(yīng)用于干、濕檢測系統(tǒng)的稀釋液只有健康人混合血清，它是比較理想的稀釋液，建議實驗室可以建立自己的混合血清標(biāo)本庫，以便用于常規(guī)生化檢測項目超限標(biāo)本的稀釋。

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