電刺激對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)生長因子表達的影響

陳虹，李俊岑，黨彥麗，劉姿辰，楊拯，張曉

脊髓是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中極易受損的部位，脊髓損傷(SCI)的致殘率高，嚴重危及人類的健康。脊髓損傷后的修復一直是醫(yī)學領域的難點。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)由 Levi-Montgalcini在 1953年首先發(fā)現(xiàn)，是神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors，NTFs)的典型代表，TrkA是其受體[1]。脊髓損傷后NGF在一定的條件下，可促進未損傷神經(jīng)元出芽，重建被破壞的神經(jīng)回路。NGF在體內和離體條件下都具有維持神經(jīng)元存活，促使軸突延伸等功能，對脊髓損傷的重建具有重要作用[2-3]。電針療法屬于針灸療法的一種，是將神經(jīng)電刺激療法與中醫(yī)針灸療法相結合而形成的。針刺入腧穴得氣后，在針灸針具上通以接近人體生物電的微量電流，利用針和電兩種刺激相結合，提高針刺的治療效果。已有研究證明，電針能夠促進NTFs的表達，維持周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)的生長、存活及修復，促進脊髓損傷的修復[4-5]。電針治療可通過促進NGF及其受體TrkA的表達來使受損神經(jīng)元得到修復，從而修復脊髓損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD大鼠72只，雌雄不限，體重(180±20)g，由四川大學實驗動物中心提供。分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20℃～25℃。隨機分為3組：損傷對照組(n=24)、電刺激組(n=24)和正常組(n=24)，各組再分成于造模后l d、3d、5 d、7 d小組，每小組6只。

1.2 動物模型制備 損傷對照組和電刺激組大鼠均用1.5%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉。背部剃毛，常規(guī)消毒。以T9為中心，縱行切開皮膚及皮下組織，剝離椎旁肌肉并暴露棘突與椎板，咬除T9椎板，按Allen法[6]用10 g沖擊棒自25 mm高處自由墜落致傷脊髓?？p合傷口。術后小心護理，獨籠飼養(yǎng)，協(xié)助大鼠排尿，每日早晚各1次，至排尿反射恢復；每日注射青霉素80000 U和生理鹽水2 ml，抗菌和補充體液，持續(xù)至大鼠取材為止。注意觀察皮膚有無壓瘡或感染，下肢有無潰爛。正常組大鼠切除相應椎板后縫合傷口。

1.3 電刺激 術后24 h起對電刺激組大鼠進行經(jīng)皮電刺激30 min，每天1次，至動物取材。參數(shù)設置：疏密波脈沖電流，電流強度中檔，刺激頻率10 Hz，正極接T7右側夾脊穴位置的皮膚，負極接右下肢足三里穴位置的皮膚。

1.4 運動功能 各組大鼠在術后1 d、3d、5 d、7 d按Basso,Beattie&Bresnahan(BBB)運動功能評分方法進行評定[7]。

1.5 取材 各組大鼠在術后1 d、3d、5 d、7 d進行取材。用過量的戊巴比妥鈉過度麻醉大鼠，自左心室插管后剪開右心耳，灌注加入肝素鈉與普魯卡因的冰生理鹽水直到有澄清液從右心耳流出，再灌注4%多聚甲醛1 h。打開椎弓管，切除T7～T11段脊髓，固定24 h后放入自動脫水包埋機處理。修片，連續(xù)切片，片厚5μm，連續(xù)5張進行貼片、烤片，備用。

1.6 免疫組織化學染色 非生物素二步法進行NGF免疫組化染色。將各組切片置于二甲苯中脫蠟，梯度酒精水化，高壓熱抗原修復，3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉非特異性抗原。滴加NGF抗體(效價1∶20)，4℃冰箱過夜。用兔抗鼠二抗37℃恒溫孵育60 min，在切片上加入DAB-H2O2顯色液，室溫下反應，顯微鏡下顯色充分，及時用0.01 mol/L PBS漂洗；蘇木素復染，梯度灑精逐級脫水，二甲苯透明，樹膠封片。顯微鏡下觀察NGF的表達，陽性結果為棕黃色反應。

1.7 Western blot 各組大鼠在脊髓損傷后1 d、3d、5 d、7 d深度麻醉后迅速取材，研磨充分。按照每g組織3 ml蛋白裂解/抽提試劑(應含抑制劑)冰水浴上超聲5次，每次2 s，間隔10 s；-20℃放置1 h后，10000 g離心30 min，取上清，280 nm紫外光吸收法初步測定蛋白濃度。電泳分離，洗板(薄厚共2塊)用洗潔精清洗，自來水沖凈，去離子水反復沖洗，組裝玻璃板，將其水平放置。制備8%分離膠溶液5 ml，取3.4 ml加入玻璃板中，覆蓋一層異丙醇(約2 ml)；分離膠聚合完全后(約30 min)，傾出覆蓋層，用去離子水清洗凝膠頂部數(shù)次以去除殘留未聚合的丙烯酰胺。盡可能排除凝膠上液體，再用濾紙吸凈殘留水。制備5%積層膠溶液5 ml，加入玻璃板至灌滿。待積層膠聚合完全后(約30 min)，置于4℃冰箱中過夜，使之聚合充分。取出凝膠板置于實驗臺上，使之減凍至室溫。在樣品中按1∶4體積比加入5×SDS凝脂上樣緩沖液配制樣品，100℃加熱3 min變性。用去離子水洗滌加樣槽，將凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸電極緩沖液。按預定順序加樣，加樣量為10～25μl(1.5 mm厚)。

1.8 統(tǒng)計學分析 用OLYMPUS數(shù)碼照像機采集圖像。觀察NGF陽性產(chǎn)物在脊髓的分布，分別計數(shù)各組脊髓內、中、外3個視野1028μm2面積內NGF的陽性細胞數(shù)；測量陽性產(chǎn)物的平均積分光密度值。各組陽性細胞數(shù)和平均積分光密度值數(shù)據(jù)以(±s)表示，用SPSS 13.0軟件進行方差分析和LSD組間比較。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 運動功能 損傷前，3組大鼠BBB評分均為21.00分。脊髓損傷后，損傷對照組、電刺激組BBB評分均小于正常組(P＜0.05)，損傷后第5天起，電刺激組BBB評分優(yōu)于損傷對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 脊髓損傷后不同時間點各組大鼠BBB評分的比較

2.2 免疫組化染色

2.2.1 正常組 NGF免疫反應陽性物主要分布于正常大鼠脊髓灰質前角神經(jīng)元內(圖1)，陽性產(chǎn)物的亞細胞定位主要分布于細胞核和胞漿。神經(jīng)元突起染色相對較淺。此外，少量膠質細胞亦見染色。

2.2.2 損傷對照組 脊髓損傷后1 d，NGF免疫反應陽性細胞數(shù)較正常時增多，但無顯著性差異(P＞0.05)；術后3d、5 d、7 d時存在顯著性差異(P＜0.05)。NGF免疫反應陽性物主要分布于大鼠脊髓灰質前角神經(jīng)元內，亞細胞定位仍是細胞核和胞漿中，神經(jīng)元突起染色較深(圖2、圖4、圖6、圖8)。

2.2.3 電刺激組 電刺激1 d，NGF免疫反應陽性細胞數(shù)較正常組和損傷對照組增多(圖3)，但無顯著性差異(P＞0.05)。電刺激3d、5 d、7 d，NGF陽性細胞數(shù)逐漸增加(圖5、圖7、圖9)，電刺激5 d、7 d，免疫陽性細胞數(shù)較正常組和損傷對照組同期增多(P＜0.05)。NGF免疫反應陽性物主要分布于大鼠灰質前角神經(jīng)元內，定位于細胞核和胞漿中，神經(jīng)元突起染色深，少量膠質細胞中NGF免疫反應陽性。各組灰質前角NGF陽性運動神經(jīng)元的數(shù)量和平均積分光密度值見表2。

2.3 Western blot檢測 電刺激組中NGF的表達比損傷對照組明顯增多。見圖10。

表2 各組脊髓NGF陽性細胞數(shù)和平均積分光密度值(n=6)

圖1 正常組(NGF免疫組化染色，400×)

圖2 損傷對照組術后1 d(NGF免疫組化染色，400×)

圖3 電刺激組術后1 d(NGF免疫組化染色，400×)

圖4 損傷對照組術后3d(NGF免疫組化染色，400×)

圖5 電刺激組術后3d(NGF免疫組化染色，400×)

圖6 損傷對照組術后5 d(NGF免疫組化染色，400×)

圖7 電刺激組術后5 d(NGF免疫組化染色，400×)

圖8 損傷對照組術后7 d(NGF免疫組化染色，400×)

圖9 電刺激組術后7 d(NGF免疫組化染色，400×)

圖10 Western blot檢測

3 討論

脊髓損傷后，提高神經(jīng)元的存活質量、促進神經(jīng)元軸突的生長及定向致靶是恢復脊髓功能的關鍵；而受損神經(jīng)元的存活及軸突的再生受內、外環(huán)境多種因素的影響。

NGF作為神經(jīng)營養(yǎng)素家族的一員，來源于靶組織，逆向營養(yǎng)神經(jīng)元，能促進皮質脊髓束與靶器官建立功能聯(lián)系和逆轉受損神經(jīng)元的萎縮，并增加神經(jīng)元的存活率，最終使受損神經(jīng)修復[8]；若得不到NGF的營養(yǎng)，近側段很快退變，神經(jīng)元胞體死亡。因此，NGF被認為是神經(jīng)再生修復的重要因子之一。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，NGF分泌增加，對維持損傷部位神經(jīng)元的存活及引導神經(jīng)纖維再生具有重要意義。但在沒有外界干預的情況下，中重度損傷內源性NGF表達量不足以起到保護和修復的作用，且維持時間較短[9]。許多學者通過給予外源性NGF、移植NGF基因修飾后的施萬細胞、成纖維細胞來增加損傷局部的NGF的濃度[10]，取得一定的治療效果。

本實驗采用術后24 h經(jīng)皮電刺激治療脊髓損傷，正極接T9右側夾脊穴，負極接右下肢足三里穴，目的是在損傷區(qū)周圍形成一個外加電場，結果發(fā)現(xiàn)損傷脊髓局部NGF表達明顯增加。

本實驗BBB評分顯示，脊髓損傷后，損傷對照組和電刺激組大鼠BBB評分值隨時間的推移而逐漸增高，且電刺激組大鼠BBB評分在脊髓損傷后5 d、7 d高于損傷對照組。這表明，電刺激有利于促進大鼠后肢功能的恢復，可能是由于電刺激誘導NGF的大量表達，減輕脊髓繼發(fā)性損傷而致。研究顯示，脊髓損傷后針刺可促使脊髓Ⅱ板層、背核和備用背根的背根節(jié)(DRG)中NGF和NGF mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)量增多，且此效應隨時間增長而加強[11]。有報道，NGF在防止脊髓繼發(fā)性損傷的病理過程中起著重要作用，可促進脊髓及背根節(jié)的運動、感覺軸突再生[12]。電針能夠提高NGF在損傷脊髓中的陽性表達[13]。

NGF表達增加的機理可能是：電針使受損傷的脊髓神經(jīng)再生建立新的軸突聯(lián)系，加速神經(jīng)營養(yǎng)因子的傳輸；也可能是電針治療加速脊髓神經(jīng)元和傳導功能的恢復對NGF的需求減少[14]。具體原因還有待進一步研究。

本實驗顯示，電刺激能誘導NGF表達，促進后肢運動功能的恢復。我們推測，電刺激NGF表達增加，從而創(chuàng)造有利于神經(jīng)再生的微環(huán)境。但脊髓損傷是一種復雜性的損傷，電刺激治療脊髓損傷中NGF表達的長期變化有待進一步研究。

[1]Sposato V,Parisi V,Manni L.Glaucoma alters the expression of NGF and NGF receptors in visual cortex and geniculate nucleus of rats:effect of eye NGF application[J].Vision Res,2009,49(1):54-63.

[2]Huang F,Dong X,Zhang L.The neuroprotective effects of NGF combined with GM1 on injured spinal cord neurons in vitro[J].Brain Res Bull,2009,79(1):85-88.

[3]Hajebrahimi Z,Mowla SJ,Movahedin M.Gene expression alterations of neurotrophins,their receptors and prohormone convertases in a rat model of spinal cord contusion[J].Neurosci Lett,2008,441(3):261-266.

[4]Paul C,Samdani AF,Betz RR.Grafting of human bone marrow stromal cells into spinal cord injury:a comparison of delivery methods[J].Spine,2009,34(4):328-334.

[5]Yamasaki K,Setoguchi T,Takenouchi T.Stem cell factor prevents neuronal cell apoptosis after acute spinal cord injury[J].Spine,2009,34(4):323-327.

[6]Allen AR.Surgery of experimental lesion of spinal cordequivalent to crush injury of fracture dislocation of spinal column:A preliminary report[J].JAm MedAssoc,1991,57:878-880.

[7]Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC,et al.MASCIS evaluation of open field locomotor scores:effete of experience and teamwork on reliability multieenter animal spinal cord injury study[J].J Neurotrauma,1996,13(7):343-359.

[8]Liel DJ,Huang W,Yong W,et al.Regulation of Trk receptor following conunsion of the rut spinal cord[J].Nerol,2001,167(1):15-26.

[9]Widenfalk J,Lundstromer K,Jubran M,et al.Neurotrophic factors and receptors in the immature and adult spinal cord after meehanical injury or kainic acid[J].J Neurosci,2001,21(10):3457-3475.

[10]Tuszynski MH,Grill R,Jones LL,et al.Spontaneous and augmented growth of axons in the primate spinal cord:Effects of local injury and nerve growth factor-secreting cell grafts[J].J Comp Neurol,2002,449(1):88-101.

[11]諶宏鳴,吳良芳,保天然.針刺對部分去背根貓脊髓和背根節(jié)NGF及mRNA的影響[J].神經(jīng)解剖學雜志,2000,16(4):311.

[12]黃純海,王廷華,李群.脊髓全橫斷大鼠神經(jīng)生長因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達及三七皂苷的干預效應[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(41):8276-8279.

[13]李曉寧,宋金柱,蘇志強.夾脊電針對大鼠脊髓損傷后NGF和BDNF表達的影響[J].哈爾濱工業(yè)大學學報,2007,39(12):2014-2016.

[14]王新家,孔抗美,葉衛(wèi)蓮,等.針刺影響慢性脊髓損傷大鼠脊髓組織神經(jīng)生長因子及其受體的表達[J].中醫(yī)正骨,2005,17(5):6-7.