鞘內(nèi)注射HPPE修飾的HEK293對(duì)骨癌痛大鼠脊髓背角pCREB表達(dá)的影響

段志祥 楊保仲 薛朝霞 郭寅南 段金緯

隨著國內(nèi)外診斷以及治療技術(shù)的進(jìn)步，癌癥患者的生命質(zhì)量已經(jīng)得到很大的提高，但是癌癥所引起的疼痛卻使患者的生活質(zhì)量大大降低。資料顯示，全球每天有將近1500萬患者經(jīng)受癌痛的折磨[1-2]。骨癌痛是一種劇烈的、頑固性的疼痛，通常是由骨骼原發(fā)性腫瘤或者其他部位的腫瘤轉(zhuǎn)移至骨，具有自發(fā)性痛、痛覺過敏和痛覺超敏的特征[3-4]。對(duì)于骨癌痛，傳統(tǒng)的止痛藥物存在不良反應(yīng)多，成癮性高的缺點(diǎn)。利用外源性阿片肽基因-人前腦啡肽原基因（HPPE)治療骨癌痛則是一種新型的治療方式。本課題組前期已將攜帶有HPPE基因的慢病毒載體PSB251(pLV-UbCHPPE），包裝后感染HEK293細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞pLVUbC-HPPE/HEK293(HH細(xì)胞)。以及該細(xì)胞的陰性對(duì)照細(xì)胞UbC-GFP-LV/HEK293（GH細(xì)胞)。本研究擬通過向大鼠鞘內(nèi)注射HH細(xì)胞，觀察其對(duì)骨癌痛大鼠行為學(xué)和脊髓背角pCREB表達(dá)的影響，探討其鎮(zhèn)痛作用。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物選擇以及分組 48只純種清潔級(jí)雌性SD大鼠，體重200～220g(編號(hào)1103002)，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)溫度20～24℃，自由進(jìn)食，飲水。實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物應(yīng)適應(yīng)環(huán)境1周。隨機(jī)分成2組，分別命名為假手術(shù)(SHAM)組（12只），骨癌痛(CIBP)組（36只）。

1.2 骨癌痛模型的制備 CIBP組大鼠麻醉后，左后肢剪毛，消毒，分離暴露左側(cè)脛骨靠近干骺端骨面，打孔。微量進(jìn)樣針將5ul MADB-106大鼠乳腺癌細(xì)胞株（購自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心）懸液緩慢注入骨髓腔內(nèi)，針孔用無菌骨蠟密封，逐層消毒縫合[5]。手術(shù)過程及相關(guān)手術(shù)器械均按照無菌手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格執(zhí)行。SHAM組按上述手術(shù)流程向骨髓腔內(nèi)注入5ul 0.9%生理鹽水。術(shù)畢注意動(dòng)物保溫，待其蘇醒后送回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3 熱刺激縮足反射潛伏期PWL測(cè)定及影像學(xué)觀察 利用IITC39熱盤儀（美國IITC Life Science 公司）行熱板實(shí)驗(yàn)，于術(shù)前1d，術(shù)后7、14、21d測(cè)定大鼠PWL。根據(jù)Eddy和Leimbach[6]法，將熱盤儀溫度調(diào)節(jié)至（55.0±0.5）℃，記錄自大鼠放在熱盤儀至舔咬后爪時(shí)間，即熱刺激縮足反射潛伏期（熱痛覺閾值）。選擇基礎(chǔ)痛閾5～20s的大鼠做測(cè)量，經(jīng)過熱板實(shí)驗(yàn)篩選，反應(yīng)異常鼠被剔除。每只大鼠測(cè)量3次，間隔5min，取其均值。為防止大鼠后爪被熱板燙傷，確定30s的時(shí)間為其中斷時(shí)間，超過30s的按照30s計(jì)算。在測(cè)試過程中應(yīng)該使熱板表面清潔干燥，遇到大鼠有糞便和尿液污染后應(yīng)及時(shí)清除并擦凈熱盤。

動(dòng)物麻醉后在各時(shí)點(diǎn)用X線對(duì)大鼠造模側(cè)進(jìn)行拍攝，觀察腫瘤細(xì)胞對(duì)脛骨的侵襲破壞程度。

1.4 大鼠蛛網(wǎng)膜穿刺置管術(shù) 根據(jù)Storkson[7]法行蛛網(wǎng)膜腔穿刺：麻醉，俯臥位，腰部墊一圓筒，從兩側(cè)髂棘定位至L6，剪毛，消毒，鋪無菌洞巾，沿背部正中切開約1cm，切開外筋膜，分離背脊肌，暴露L5～L6棘突間隙。挑破黃韌帶以及硬脊膜，經(jīng)黃韌帶插入導(dǎo)管時(shí)，可見典型的大鼠甩尾動(dòng)作。向頭端置入蛛網(wǎng)膜下腔2cm，導(dǎo)管另外一端可見清亮的腦脊液流出。將導(dǎo)管加固于韌帶上以防脫落，逐層縫合。用50ml注射器針頭從大鼠背部皮下穿過至頸部，將導(dǎo)管從大鼠頸部引出。外露2～3cm，用熱熔法封住導(dǎo)管外口，防止腦脊液的外漏，消毒縫皮，放回籠子單養(yǎng)。

1.5 鞘內(nèi)注射，拮抗劑納洛酮實(shí)驗(yàn)以及PWL測(cè)定 CIBP組骨癌痛模型造成后，測(cè)定PWL。隨機(jī)分為三組，分別命名為CIBP′，CIBP′+GH，CIBP′+HH組，均12只。據(jù)涂會(huì)引[8]法打開鞘內(nèi)置管封口，回抽有腦脊液流出，用微量注射針分別向CIBP′，CIBP′+GH，CIBP′+HH組注射PBS液，GH和HH細(xì)胞懸液各20ul，然后用15ul人工腦脊液沖入。整個(gè)給藥過程慢速均勻，15s內(nèi)注射完畢,封閉管口。隔天，共3次。術(shù)后密切關(guān)注大鼠情況，避免大鼠顱內(nèi)高壓的產(chǎn)生。CIBP′，CIBP′+GH，CIBP′+HH組鞘內(nèi)注射后，測(cè)定大鼠PWL。

CIBP′+HH組大鼠腹腔注射納洛酮(0.8mg/100g)，再次測(cè)定PWL。

1.6 免疫組化染色 腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，大鼠仰臥位固定鼠板上，迅速剪開大鼠胸膛暴露心臟，經(jīng)主動(dòng)脈建立通路，依次灌入生理鹽水250ml，4%的多聚甲醛500ml，待全身僵硬后解剖，取脊髓L4～L6置于4%多聚甲醛中再固定2h，入30%蔗糖脫水，過夜沉底，行冰凍冠狀切片，切片厚度20um，選片，SABC免疫組織化學(xué)技術(shù)染色（即用型SABC免疫組化染色試劑盒，武漢博士德公司）：按1:1滴加5%BSA封閉液和triton x-100（AMRESCO公司，美國）。2h后加兔抗pCREB(1:100，Bioworld Technology公司，美國)，4℃冰箱孵育過夜。滴加二抗，室溫孵育30min后，加入SABC（鏈霉親和素-生物素-酶復(fù)合物），室溫下孵育30min,DAB顯色，硫酸鎳胺加強(qiáng)顯色。貼片，晾干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。每只大鼠選取5張切片，用奧林巴斯BX51顯微鏡（Olympus，日本）觀察脊髓背角灰質(zhì)Ⅰ，Ⅱ?qū)?，pCREB免疫組化染色以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒細(xì)胞為陽性，用image-pro Plus6.0軟件分析，測(cè)定pCREB陽性細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p-CREB細(xì)胞計(jì)數(shù)為計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察 CIBP組造模術(shù)后7d、14d、21d，大鼠行為學(xué)逐漸發(fā)生改變，出現(xiàn)疼痛引起的自發(fā)性縮足反射，并呈進(jìn)行性加重，造模側(cè)出現(xiàn)活動(dòng)能力逐漸下降直至拖地行走。而SHAM組左右肢未出現(xiàn)此種現(xiàn)象。

2.2 骨癌痛模型大鼠造模側(cè)脛骨X線觀察 大鼠術(shù)前1d，術(shù)后7d并未見異常情況（圖B），14d可見接種的部位有放射性缺失病灶（圖C)，21d顯示可有骨破壞，骨皮質(zhì)的缺失(圖D）(見圖1）。

圖1 脛骨X線觀察。A:術(shù)前1d，B:術(shù)后7d，C:術(shù)后14d，D:術(shù)后21d。

2.3 PWL測(cè)定 SHAM組：造模術(shù)前術(shù)后PWL相比沒有發(fā)生變化。CIBP組：與術(shù)前1d PWL相比，術(shù)后7d時(shí)PWL開始下降（P<0.05)，術(shù)后14d、21d PWL值進(jìn)一步下降（P<0.05)，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注射PBS，GH細(xì)胞和HH細(xì)胞后，CIBP′+HH組PWL值與CIBP′和CIBP′+GH組相比均有了增加（P<0.05)。CIBP′+HH組大鼠腹腔注射納洛酮后PWL與鞘內(nèi)注射后的值相比降低（P<0.05)，30min后恢復(fù)（見表1、2）。

表1 大鼠骨癌痛組與對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)PWL變化比較

表2 大鼠各時(shí)點(diǎn)PWL值變化比較（s,χ±s)

2.4 各組大鼠脊髓背角pCREB陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá) SHAM組脊髓背角神經(jīng)元pCREB染色淺，且陽性細(xì)胞數(shù)少，為（13.87±2.76）。CIBP′組大鼠脊髓背角神經(jīng)元pCREB染色較深，且陽性細(xì)胞數(shù)較多，為（54.21±5.03）。CIBP′+GH組陽性細(xì)胞數(shù)為（53.53±5.16），與CIBP′組比（P>0.05)。CIBP′+HH組陽性細(xì)胞數(shù)，為（38.73±3.92），與CIBP′組相比,大鼠脊髓背角pCREB染色變淺，陽性細(xì)胞數(shù)量也變少，pCREB表達(dá)量降低（P<0.05)(見圖2）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首先建立大鼠骨癌痛模型。接種癌細(xì)胞7d、14d、21d后發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)舔足，懸空等自發(fā)性痛行為，造模側(cè)活動(dòng)能力進(jìn)行性下降；熱板實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PWL明顯降低；大鼠造模側(cè)脛骨X線也表明大鼠骨癌痛動(dòng)物模型成功建立。骨癌痛的具體發(fā)生機(jī)制目前仍不清楚，其本身是一種非常復(fù)雜的慢性疼痛。研究表明[9]，骨癌痛有著慢性炎癥痛和神經(jīng)病理性痛的一些特征，但不是兩者的簡(jiǎn)單相加，有著其獨(dú)自的特征。腫瘤生長過程中分泌的前列腺素、白細(xì)胞介素1、內(nèi)皮素等腫瘤壞死因子，以及炎癥細(xì)胞形成后分泌各種炎癥因子，骨骼重建過程中溶骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞分泌生長因子等，這些都形成了癌癥微環(huán)境[9-11]。這些因子和腫瘤的壓迫、壞死、缺血不斷刺激神經(jīng)末梢，引起初級(jí)傳入神經(jīng)元興奮性升高，導(dǎo)致外周敏化（peripheral sensitization）[12]。胡計(jì)嬅[13]等在研究中指出：外周敏化可使大量初級(jí)傳入神經(jīng)元遞質(zhì)釋放，遞質(zhì)作用于脊髓背角神經(jīng)元上相應(yīng)受體，通過多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑作用于下游底物環(huán)磷酸腺苷（cAMP）反應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB,CREB發(fā)生磷酸化后被激活，促使疼痛相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。CREB通路的功能改變是慢性疼痛形成及維持的機(jī)制[14]。因此pCREB在神經(jīng)損傷后在中樞和外周敏化的過程中起了重要的作用。

圖2 脊髓背角pCREB免疫組化染色 (SABC法，×100倍)。

HPPE編碼的是人前腦啡肽，在其翻譯的過程中經(jīng)不同的蛋白酶降解后形成兩個(gè)內(nèi)源性活性阿片肽：腦內(nèi)甲硫氨酸腦啡肽和亮氨酸腦啡肽。兩種阿片肽都參與了機(jī)體對(duì)疼痛信號(hào)調(diào)控，但它們并不進(jìn)入細(xì)胞，而是只與神經(jīng)細(xì)胞膜上的δ和μ阿片受體結(jié)合，改變痛覺傳入纖維（Aδ和C纖維）對(duì)疼痛刺激信號(hào)的反應(yīng)性，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[15]。Atchison等[16]人的研究得出：大鼠腦室應(yīng)用微量（200ng）腦啡肽就可以產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，大鼠椎管內(nèi)大劑量（10mg)應(yīng)用腦啡肽也無明顯的呼吸循環(huán)功能障礙，證明其安全系數(shù)很高。蛛網(wǎng)膜下腔移植HPPE修飾細(xì)胞可以有效改善神經(jīng)性疼痛，其鎮(zhèn)痛效應(yīng)通過阿片受體介導(dǎo)[17]。

血腦屏障能控制進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的物質(zhì)，尤其對(duì)水溶性化合物通透性很低，使免疫調(diào)節(jié)分子及免疫活性細(xì)胞等不能通過，難以發(fā)生免疫應(yīng)答[18]。蛛網(wǎng)膜下腔的免疫功能相比其他組織對(duì)外源細(xì)胞的免疫排斥要弱。鑒于此，本課題組前期實(shí)驗(yàn)用人來源的HEK293細(xì)胞作為工具細(xì)胞，通過構(gòu)建含有人前腦啡肽原基因（HPPE）的慢病毒載體，經(jīng)過包裝后，感染，篩選出穩(wěn)定表達(dá)該基因的HEK293細(xì)胞。將該細(xì)胞注射到大鼠蛛網(wǎng)膜下腔觀察其對(duì)大鼠骨癌痛的影響。遠(yuǎn)期目標(biāo)是將該細(xì)胞注入到骨癌痛病人的蛛網(wǎng)膜下腔觀察能否產(chǎn)生滿意的骨癌痛鎮(zhèn)痛效果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鞘內(nèi)注射HH細(xì)胞后，改變了骨癌痛大鼠行為學(xué)并降低了慢性疼痛CREB傳導(dǎo)通路中脊髓背角pCREB的表達(dá)。說明鞘內(nèi)注射該細(xì)胞后，在癌痛大鼠蛛網(wǎng)膜下腔存活且表達(dá)了少量的人前腦啡肽，對(duì)骨癌痛起到了一定鎮(zhèn)痛作用，且鎮(zhèn)痛效果可以被納洛酮拮抗。實(shí)驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)雖然大鼠PWL增加，但pCREB表達(dá)減少程度并不明顯，說明目的基因表達(dá)不是十分理想。原因可能是：雖然血腦屏障對(duì)免疫調(diào)節(jié)分子和免疫活性細(xì)胞通透性低,但在病理狀態(tài)下[19]，處在骨癌疼痛當(dāng)中的大鼠血腦屏障有可能出現(xiàn)通透性增高；或可能在行蛛網(wǎng)膜下腔穿刺置管時(shí)，將大鼠血液帶入蛛網(wǎng)膜下腔，而血液中存在相應(yīng)的免疫分子，導(dǎo)致外源細(xì)胞被免疫。因此，該細(xì)胞能否長期存活并持續(xù)分泌鎮(zhèn)痛物質(zhì)，仍需進(jìn)一步研究。

另外，利用攜帶HEEP的慢病毒載體，包裝后，收集假病毒顆粒直接注射大鼠蛛網(wǎng)膜下腔，使其感染大鼠細(xì)胞，使目的基因整合到大鼠細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)HEEP，觀察是否能產(chǎn)生持續(xù)的骨癌鎮(zhèn)痛作用，這也是本課題下一步的研究目標(biāo)。

綜上所述，大鼠慢性骨癌痛可導(dǎo)致其熱痛閾值降低，脊髓背角pCREB表達(dá)增加，而通過鞘內(nèi)注射HPPE基因修飾的HEK293細(xì)胞后，可使大鼠熱痛閾值提高，脊髓背角pCREB表達(dá)降低，表明該重組細(xì)胞對(duì)大鼠骨癌痛有鎮(zhèn)痛效果，其鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與抑制pCREB的表達(dá)有關(guān)。

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