楊雨輝,俞觀泉,吳 昊
(1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院,海口 570311;2.海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,???570228)
使用體內(nèi)建立藥動(dòng)學(xué)模型方法評(píng)價(jià)抗菌藥物對(duì)病原菌藥效,可使研究結(jié)果更接近客觀實(shí)際。已有研究者使用動(dòng)物感染模型分析抗菌藥物對(duì)某些人源性病原菌的療效,并以此為依據(jù)獲得一些評(píng)價(jià)抗菌藥物臨床療效的新觀點(diǎn)[1-2]。在獸醫(yī)臨床上,Ramadan等使用綠膿桿菌感染雞的疾病模型進(jìn)行PK-PD的研究,并獲得一些PK-PD參數(shù)[3],但是這些研究大部分都不能準(zhǔn)確獲得抗菌藥物在感染部位的濃度和細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線[4]。因此需要更好的體內(nèi)模型來(lái)進(jìn)行抗菌藥物體內(nèi)藥效研究。
根據(jù)Bengtsson和Creko的研究,使用組織籠模型進(jìn)行體內(nèi)PK-PD研究可解決以上問(wèn)題,在研究中將藥物直接注射到組織籠中,以克服其他給藥途徑下組織籠內(nèi)藥物濃度變化緩慢的缺點(diǎn),組織籠也可以直接注射病原菌,進(jìn)行組織籠內(nèi)病原菌數(shù)量變化的的研究。利用該模型研究抗菌藥物體內(nèi)PK-PD關(guān)系是較理想的一種方法[5-6]。本研究利用在豬體內(nèi)安裝組織籠的方法,探討恩諾沙星在組織籠內(nèi)對(duì)大腸桿菌的藥效。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及菌種
18頭健康的商品雜交豬(杜洛克×海南豬),體重(59.7±6.3)kg。按常規(guī)飼養(yǎng),自由飲水和采食,飼料為不含抗菌藥物的全價(jià)日糧。試驗(yàn)前適應(yīng)2周。大腸桿菌2081(44103)為購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的標(biāo)準(zhǔn)菌株。
1.1.2 藥品及培養(yǎng)基
鹽酸恩諾沙星為浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司生產(chǎn);恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供;乙腈為美國(guó)TEDIA公司產(chǎn)品;四丁基溴化銨均為上海晶純?cè)噭┯邢薰井a(chǎn)品;普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。
1.2.1 組織籠的準(zhǔn)備及安裝
組織籠的準(zhǔn)備,選取直徑為2.5和3 cm的不銹鋼半球和鋼管,首先將鋼質(zhì)半球用2 mm的鉆頭均勻鉆孔,鉆時(shí)注意保持鉆孔間距為3 mm左右,同時(shí)將直徑為2.5 cm的鋼管截成長(zhǎng)度為3.5 cm的小段,直徑為3 cm的鋼管截成長(zhǎng)度為4 cm的小段,并將直徑相同的鋼管與鉆孔的半球焊接,腔內(nèi)預(yù)先放置4~5粒直徑為3 mm的玻璃珠,打磨表面使其光滑,兩種籠的容積分別約為25和42 mL左右,見圖1。試驗(yàn)前將鋼質(zhì)組織籠洗凈、包扎、滅菌并烘干備用。
圖1 組織籠Fig.1 Tissue cages
組織籠的安裝,選擇試驗(yàn)用健康豬,以普魯卡因(5 g·L-1)在豬的耳后頸部?jī)蓚?cè)進(jìn)行局部浸潤(rùn)麻醉后,分別于兩側(cè)皮膚以無(wú)菌手術(shù)分別切開皮膚至岡上肌,形成4~5 cm的小口,鈍性分離,使岡上肌和頸斜方肌之間形成小腔,分別植入一大一小兩個(gè)組織籠并縫合切口。術(shù)后連續(xù)3 d每公斤體重注射青霉素鈉4萬(wàn)單位,鏈霉素每公斤體重15 mg,每天兩次,防止傷口感染。1周后拆線。2周時(shí)以無(wú)菌注射器抽空組織籠內(nèi)組織碎片。5周后手術(shù)部位基本恢復(fù)正常。
1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與采樣
MIC的測(cè)定,采用雙倍試管稀釋法測(cè)定恩諾沙星對(duì)大腸桿菌的MIC。為了與組織籠內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量一致,本試驗(yàn)測(cè)定MIC時(shí)加入的細(xì)菌量大約是5×107cfu·mL-1。
體內(nèi)PK-PD同步試驗(yàn)的設(shè)計(jì),18頭實(shí)驗(yàn)豬,分為三組,每組6頭,每頭具有4個(gè)組織籠,頸部?jī)蓚?cè)分別具有一大一小兩個(gè)組織籠。試驗(yàn)前24 h將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌稀釋10-2后,小籠取1 mL,大籠取1.5 mL(菌液的濃度大約為5×105cfu·mL-1)注射進(jìn)入組織籠,制作一個(gè)感染模型,待細(xì)菌在組織籠內(nèi)孵育24 h后,開始進(jìn)行試驗(yàn),此時(shí)即為體內(nèi)PD-PK模型的0時(shí)。于試驗(yàn)0時(shí)按照組織籠終濃度為2MIC,5MIC和8MIC,既組織籠藥物內(nèi)藥物終濃度為0.8、2.0、3.2 μg·mL-1的劑量向組織籠注入50 mg·mL-1的恩諾沙星溶液,頸部的一側(cè)作為對(duì)照籠,不注射藥液。分別于試驗(yàn)后0、0.25、0.5、1、3、6、9、12、24、48 h采取組織籠液1 mL,其中0.5 mL進(jìn)行細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定,0.5 mL進(jìn)行藥物濃度的測(cè)定。
1.2.3 體內(nèi)抗菌活性的測(cè)定
通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)確定組織籠液中活菌數(shù)的變化。
1.2.4 藥物濃度的測(cè)定
采用高效液相色譜對(duì)藥物濃度進(jìn)行測(cè)定[16]。
1.2.5 數(shù)據(jù)處理
使用Winnolin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的計(jì)算,并獲得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。
藥效數(shù)據(jù)中的細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)時(shí)間的曲線下面積(AUBKC)計(jì)算根據(jù)兩個(gè)鄰近樣品點(diǎn)所圍成的梯形面積之和進(jìn)行計(jì)算。
頸部已成功安裝組織籠的豬如圖2所示。安裝完成后傷口愈合完好,可抽出淡黃色清亮的組織液,說(shuō)明該豬可用于試驗(yàn)研究。
圖2 頸部安裝組織籠的豬Fig.2 Swines assembled the tissue cages
在此試驗(yàn)條件下,恩諾沙星對(duì)大腸桿菌的MIC為0.4 μg·mL-1。恩諾沙星在大、小組織籠內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征符合一室模型的藥動(dòng)學(xué)特征,藥動(dòng)學(xué)參數(shù)及藥動(dòng)-藥效參數(shù)參數(shù)見表1。
表1 恩諾沙星在豬不同大小組織籠內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)及藥動(dòng)-藥效參數(shù)(X±S,n=6)Table 1 Pharmacokinetic parameters and PK-PD parameters of enrofloxacin in the tissue cage of swine(X±S,n=6)
結(jié)果表明注射相同的藥物濃度后,藥物在小組織籠內(nèi)的半衰期明顯大于在大組織籠內(nèi)的半衰期,差異顯著(P<0.05),在相同大小的組織籠內(nèi)隨著藥物濃度的增加半衰期表現(xiàn)為增長(zhǎng)。
恩諾沙星在大組織籠內(nèi)對(duì)大腸桿菌的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線見圖3,在大組織籠內(nèi),無(wú)藥對(duì)照籠內(nèi)的細(xì)菌在試驗(yàn)的過(guò)程中細(xì)菌的數(shù)量基本上保持恒定,大組織籠內(nèi)注入2MIC的恩諾沙星后,細(xì)菌在被抑制9 h后,出現(xiàn)再生長(zhǎng)現(xiàn)象,大組織籠內(nèi)注入5MIC或8MIC的恩諾沙星后,細(xì)菌的殺菌曲線幾乎重合,并都在24 h后檢測(cè)不到組織籠內(nèi)細(xì)菌的存在。細(xì)菌在接觸藥物的早期階段下降最為迅速。
恩諾沙星在小組織籠內(nèi)對(duì)大腸桿菌的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線見圖4。在小組織籠內(nèi),無(wú)藥對(duì)照籠內(nèi)的細(xì)菌在試驗(yàn)的過(guò)程中細(xì)菌的數(shù)量也基本上保持恒定,小組織籠內(nèi)注入2MIC的恩諾沙星后,細(xì)菌在被抑制12 h后,出現(xiàn)再生長(zhǎng)現(xiàn)象,小組織籠內(nèi)注入5MIC或8MIC的恩諾沙星后,細(xì)菌的殺菌曲線幾乎重合,小籠注入5MIC的藥物濃度后,籠內(nèi)在24 h后檢測(cè)不到細(xì)菌的存在,而注入8MIC藥物濃度的小籠,在注藥12 h后,組織籠內(nèi)就不再能夠檢測(cè)到大腸桿菌的存在。小籠內(nèi)細(xì)菌在接觸藥物的早期階段也表現(xiàn)為迅速下降。
圖3 不同濃度恩諾沙星在大組織籠內(nèi)的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Killing bacteria curve of different concentration enrofloxacin in the big tissue cage
圖4 不同濃度恩諾沙星在小組織籠內(nèi)的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 Killing bacteria curve of different concentration enrofloxacin in the small tissue cage
組織籠內(nèi)細(xì)菌暴露于不同濃度藥物后3 h內(nèi)活菌數(shù)減少的對(duì)數(shù)值見表2。
表2 注射恩諾沙星后在組織籠內(nèi)3h內(nèi)活菌數(shù)減少值(logcfu·mL-1,X±S,n=6)Table 2 Decreasing value of the valid bacteria in 3 hours after injecting enrofloxacin(logcfu·mL-1,X±S,n=6)
在大小組織籠注入不同濃度恩諾沙星,在接觸細(xì)菌3小時(shí)內(nèi)殺滅大腸桿菌的程度比較表明,2MIC與其他各濃度在3 h內(nèi)菌數(shù)減少的lg值之間差異顯著(P<0.05)。從5MIC到8MIC濃度在3 h內(nèi)菌數(shù)減少的lg值之間差異不顯著(P>0.05)。
不同藥物不同濃度在組織籠內(nèi)殺菌曲線下面積的結(jié)果見表3。對(duì)于恩諾沙星,隨著抗菌藥物的濃度增加,表現(xiàn)為殺菌曲線下面積減少。
表3 不同濃度恩諾沙星在組織籠內(nèi)殺菌曲線下面積(X±S,n=6)Table 3 Area under the bacterial kill curve of different concentration enrofloxacin in tissue cage(X±S,n=6)
對(duì)于使用組織籠研究抗菌藥物的療效研究,多采用動(dòng)物一側(cè)給藥而另一側(cè)作為對(duì)照的方法進(jìn)行試驗(yàn)[6]。在本研究中,采用此試驗(yàn)設(shè)計(jì),主要是從給藥的劑量和方式來(lái)考慮。兩個(gè)組織籠容積共有67 mL,豬體重60 kg,組織籠容積相對(duì)于豬的體積可以忽略。以組織籠的大小為依據(jù)計(jì)算給藥劑量,藥量少,由于采用直接向組織籠內(nèi)注藥,藥物半衰期相對(duì)很長(zhǎng)。因此,在試驗(yàn)期間進(jìn)入血液藥量較少,而進(jìn)入另一個(gè)組織籠的藥量更少,故可以忽略用藥量對(duì)對(duì)照組織籠內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生的影響,因此本研究采用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)可達(dá)到研究目的。
本研究直接向組織籠內(nèi)注藥,沒(méi)有藥物吸收過(guò)程,此種給藥方式與靜注給藥的藥動(dòng)過(guò)程相仿,因此在進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的計(jì)算時(shí),采用一室靜注給藥模型進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算。計(jì)算結(jié)果表明所有模擬的相關(guān)系數(shù)R都在0.9以上,說(shuō)明靜注一室模型可較好地模擬組織籠注射藥物后藥動(dòng)學(xué)特征。
使用組織籠研究抗菌藥物的抗菌效果發(fā)現(xiàn),動(dòng)物給藥后,組織籠內(nèi)的藥物濃度上升和下降速度非常緩慢[7-12],為了克服肌肉注射后,組織籠內(nèi)藥物濃度上升和消除緩慢這一缺點(diǎn),本研究采用直接向組織籠內(nèi)注射藥物方式進(jìn)行給藥,結(jié)果表明,此方法可以克服肌肉注射給藥后藥物在組織籠內(nèi)濃度較低和半衰期較長(zhǎng)缺點(diǎn),使得恩諾沙星在組織籠的半衰期較肌肉注射給藥后藥物在組織籠內(nèi)的半衰期降低了近一半[13],且可以通過(guò)控制注射藥物劑量控制組織籠內(nèi)藥物濃度,是目前研究抗菌藥物在動(dòng)物體內(nèi)PK-PD同步關(guān)系較為理想的方法。
在本研究中藥物在小組織籠內(nèi)的半衰期明顯大于在大組織籠內(nèi)的半衰期,差異顯著(P<0.05),在相同大小的組織籠內(nèi)隨著藥物濃度的增加半衰期表現(xiàn)為增長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道藥物在牛組織籠內(nèi)的半衰期隨著藥物的不同和組織籠大小也存在著差異,在相同大小的組織籠內(nèi),隨著藥物濃度的增加,藥物的半衰期增加,這與本研究的結(jié)果相同,但對(duì)于籠的大小與半衰期關(guān)系的結(jié)果卻與本研究相反[5-6]。根據(jù)分析這主要是由于本研究中使用的組織籠大小和形狀設(shè)計(jì)與Greko對(duì)組織籠的大小和形狀設(shè)計(jì)不同導(dǎo)致的。在Greko的研究中,使用的大小組織籠只是長(zhǎng)短上有差異,籠端面積,即籠內(nèi)液體與籠外組織接觸面積是相同的,所以結(jié)果表現(xiàn)為藥物在大籠(長(zhǎng)組織籠)內(nèi)半衰期長(zhǎng),而在小籠(短組織籠)內(nèi)半衰期短。本研究使用的大小組織籠直徑不同,長(zhǎng)短差異較小,故藥物在小組織籠內(nèi)半衰期長(zhǎng),而在大組織籠內(nèi)半衰期短的特點(diǎn)。
制作感染籠并直接向組織籠中注入藥物,可以確切了解局部感染用藥后的治療效果,如果已經(jīng)明確某藥物在該局部的藥動(dòng)學(xué)特征,就可以通過(guò)改變組織籠的大小和形狀,控制藥物在組織籠內(nèi)的半衰期,使其與該局部的藥動(dòng)學(xué)特征相符。使用此研究方法,對(duì)研究動(dòng)物用藥后某部位的具體療效具有指導(dǎo)作用。
由組織籠內(nèi)細(xì)菌暴露于不同濃度藥物后3 h內(nèi)活菌數(shù)減少值可見,在動(dòng)物組織籠內(nèi)恩諾沙星的藥效與藥物濃度有關(guān),藥效呈隨濃度增加而增加趨勢(shì),此規(guī)律在體外模型的研究中已有報(bào)道[16],說(shuō)明在豬體內(nèi)恩諾沙星的殺菌規(guī)律與體外結(jié)果一致。由于體內(nèi)條件下還涉及到宿主的免疫因素,因此體內(nèi)試驗(yàn)更接近客觀事實(shí)。
在以前的報(bào)道中,認(rèn)為峰濃度和AUC是氟喹諾酮類藥物發(fā)揮抗菌作用的關(guān)鍵因素,且氟喹諾酮類藥物的peak/MIC比率對(duì)于臨床療效和減少耐藥性是最重要參數(shù)[14-16]。本研究中,大組織籠內(nèi)注入2MIC的恩諾沙星后,細(xì)菌在被抑制9 h后,出現(xiàn)再生長(zhǎng)現(xiàn)象,大組織籠內(nèi)注入5MIC或8MIC的恩諾沙星后,細(xì)菌的殺菌曲線幾乎重合,這說(shuō)明5MIC和8MIC的殺菌強(qiáng)度相同,并都在24 h后檢測(cè)不到組織籠內(nèi)細(xì)菌。而在小組織籠內(nèi)注入2MIC的恩諾沙星后,細(xì)菌在被抑制 12 h后,出現(xiàn)再生長(zhǎng)現(xiàn)象,小籠注入5MIC的藥物濃度后,籠內(nèi)在24 h后檢測(cè)不到細(xì)菌,而注入8MIC藥物濃度的小籠,在注藥12 h后,組織籠內(nèi)就檢測(cè)不到大腸桿菌。由以上結(jié)果表明,當(dāng)藥物濃度較低時(shí),細(xì)菌可出現(xiàn)再生長(zhǎng)現(xiàn)象,半衰期決定了藥物出現(xiàn)再生長(zhǎng)的時(shí)間,半衰期長(zhǎng)的出現(xiàn)再生長(zhǎng)的時(shí)間較晚。當(dāng)濃度較高時(shí)細(xì)菌可被完全殺滅,但完全殺滅的時(shí)間也與半衰期有關(guān),相同的藥物濃度,半衰期長(zhǎng)的殺滅細(xì)菌的速度快。此結(jié)果在體外藥動(dòng)藥效同步模型研究中被發(fā)現(xiàn)[17],Blaser等在使用體外模型研究依諾沙星對(duì)幾種細(xì)菌的體外藥效時(shí),也觀察到細(xì)菌的再生長(zhǎng)現(xiàn)象,在所有的peak/MIC比率中,只有peak/MIC>8,才能避免細(xì)菌在模型內(nèi)的再生長(zhǎng)[18]。本試驗(yàn)中peak/MIC>5,組織籠內(nèi)的細(xì)菌就不會(huì)出現(xiàn)再生長(zhǎng)現(xiàn)象。這說(shuō)明,如果藥物在體內(nèi)消除慢,可以適當(dāng)減少抗菌藥物的用量。恩諾沙星對(duì)大腸桿菌的藥效與濃度有直接關(guān)系,如藥物在感染部位的半衰期長(zhǎng),用藥量可適當(dāng)減少。
[1] Vogelman B,Gudmundsson S,Leggett J,et al.Correlation of antimicrobial pharmacokinetic parameters with therapeutic efficacy in an animal model[J].J Infect Dis,1988,158(4):831-847.
[2] Legget J E,Ebert S,Fantin B,et al.Comparative dose-effect relations ant several dosing intervals for betalactam,aninoglycoside and quinolone antibiotics against gram-negative bacilli in murine thigh-infection and pneumonitis models[J].Scand J of Infect Dis.1990,74(Suppl.):179-184.
[3] Ramadan A,Afifina,Osman K M,et al.Pharmacokinetics and pharmacodynamics of gentamicin in experimentally pseudomonas aeruginosa-infected Chickens[C]//.Proceedings of 6th international Congress.Boston:Blackwell Scientific Publications,1994:61-62.
[4] Wright D H,Brown G H,Peterson M L,et al.Application of fluoroquinlone pharmacodynamics[J].J Antimicrob Chemoth,2000,46(5):669-683.
[5] Bengtsson B,Greko C.Simulation of concentration-time profiles of benzyl-penicillin,enrofloxacin and dihydrostreptomycin in tissue cages in calves[J].J vet Pharmacol.Therap,2002,25(5):389-392.
[6] Greko C,Finn M,Ohagen P,et al.A tissue cage model in calves for studies on pharmacokinetic/pharmacodynamic interactions of antimicrobials[J].Int J Antimicrob Ag,2003,22(4):429-438.
[7] Kaye D,Parsons J N,Carrizosa,et al.Treatment of experimentalStaphylococcus aureusabscesses:Comparison of cefazolin,cephalothin,cefoxitin,and cefamandole[J].Antimicrob Agents Ch,1979,15(2):200-203.
[8] Roos K,Brorson J E,Holm S E.Studiesin vivoon the killing rate and refractory period of penicillin V in an experimental streptococcal infection[J].J Antimicrob Chemoth,1985,15(5):587-595.
[9] Readle R E,Short C R,Corstvet R E,et al.Characteriztion of a soft tissue infection model in the horse and its response to intravenous cephapirin administration[J].J Vet Pharmacol Ther,1989,12(1):73-86.
[10] Clark C R,Short C R,Corstvet R E,et al.Effect ofPasteurellahaemolytica infection on the distribution of sulfadiazine and trimethoprim into tissue chambers implanted subcutaneously in cattle[J].Am J Vet Res,1989,50(9):1551-1565.
[11] Cagni A,Chuard C,Vaudaux P E,et al.Comparison of sparfloxacin,temafloxacin and ciprofloxacin for prophylaxis and treatment experimental foreign body infection by methicillin resistantStaphylococcus aureus[J].Antimicrob Agents Ch,1995,39(8):1655-1660.
[12] Xuan D,Zhong M,Mattoes H,et al.Streptococcuspneumoniae reponse to repeated moxifloxacin or levofloxacin exposure in a rabbit tissue cage model[J].Antimicrob Agents Ch,2001,45(3):794-799.
[13] 楊雨輝,李笑春,韓新疇,等.恩諾沙星在豬血清和組織液中對(duì)大腸桿菌的半體內(nèi)藥動(dòng)-藥效同步模型的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,42(1):92-98.
[14] Chambers S T,Peddie B A,Begg E J,et al.Antimicrobial effects of lomefloxacinin vitro[J].J Antimicrob Chemoth,1991,27(4):481-489.
[15] Drusano G L,Johnson D E,Rosen M,et al.Pharmacodynamics of a fluoroquinolone antimicrobial agent in a neutropenic rat model of pseudomonas sepsis[J].Antimicrob Agents Ch,1993,37(3):483-490.
[16] Marchbanks C R,Mckiel J R,Gilbert,et al.Dose ranging and fractionation of intravenous ciprofloxacin againstPseudomonas aeruginosaandStaphylococcus aureusin anin vitromodel of infection[J].Antimicrob Agents Ch,1993,37(9):1756-1763.
[17] 楊雨輝,丁煥中,楊東,等.體外藥動(dòng)學(xué)模型中恩諾沙星對(duì)豬大腸桿菌的藥效研究[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2007,37(7):636-640.
[18] Blaser J,Stone B B,Groner M C,et al.Comparative study with enoxacin and netilmicin in apharmacodynamic modelto determine importance of ratio of antibiotic peak concentration to MIC for bactericidal activity and emergency of resistance[J].Antimicrob Agents Ch,1987,31(7):1054-1060.