瘤胃真菌體外產(chǎn)纖維素酶條件的篩選

厲學(xué)武，王利華，孫艷朋

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

纖維素類物質(zhì)是自然界中存在的最廉價(jià)、最豐富的一類可再生資源。然而纖維素分子形成緊湊的、富含氫鍵的、嵌入在植物細(xì)胞壁的微纖維，所以纖維素很難被利用［1］。纖維素酶可以將纖維素降解為單糖，因此提高纖維素酶產(chǎn)量和活力是解決纖維素利用的重要前提。

自從Orpin 1975年發(fā)現(xiàn)厭氧真菌以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明，厭氧真菌可分泌高活性纖維素酶、木聚糖酶和酯酶等多種酶，并在植物纖維降解中起著重要作用［2］。目前從瘤胃中分離得到的真菌共計(jì)6個(gè)屬10余個(gè)種之多，所有已分離出的瘤胃真菌都具有溶解纖維的特性，并且都具有降解植物細(xì)胞壁中結(jié)構(gòu)性碳水化合物的能力［3］。研究還發(fā)現(xiàn)，瘤胃真菌首先分離木質(zhì)化的纖維組織，從而為細(xì)菌利用與木質(zhì)素結(jié)合的纖維物質(zhì)創(chuàng)造條件。雖然細(xì)菌是瘤胃內(nèi)主要分解纖維的微生物，但瘤胃真菌壁降解的貢獻(xiàn)可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)細(xì)菌。通過(guò)對(duì)發(fā)酵后植物片段殘余物的比較表明，瘤胃真菌對(duì)厚壁組織的降解顯著高于瘤胃細(xì)菌［4］。

瘤胃真菌產(chǎn)生的木聚糖酶比瘤胃主要的纖維分解細(xì)菌產(chǎn)生的酶活力高5倍，比原蟲(chóng)和目前工業(yè)上常用的產(chǎn)纖維素木酶菌Thichoderma reesei菌株C-30等工業(yè)用產(chǎn)酶的微生物分泌的酶活力均高［5］。本試驗(yàn)采用L9（34）正交試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定木聚糖酶和羧甲基纖維素酶活以篩選嶗山奶山羊瘤胃真菌產(chǎn)酶的最優(yōu)發(fā)酵條件，提高瘤胃真菌產(chǎn)酶活性，為纖維素酶的研發(fā)提供應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株 瘤胃液取自裝有永久性瘤胃瘺管的成年嶗山奶山羊。采食后2h，經(jīng)瘤胃瘺管從瘤胃抽取瘤胃液，放入充滿二氧化碳的大離心管中，10mL的瘤胃液加入液體培養(yǎng)基（含有1000IU／mL的青霉素；1600μg／mL的鏈霉素，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)），稀釋10倍進(jìn)行培養(yǎng)，制成真菌混合懸浮液用于接種。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)分別采用L9（34）正交表，氮源分別為（NH4）2SO4、NH4Cl和尿素；接種量分別為5mL、10mL和15mL（液體培養(yǎng)基的量分別為95mL、90mL和85mL）；培養(yǎng)基起始pH值分別為7.0、6.0和5.0；發(fā)酵溫度分別為35℃、37℃和39℃，共9個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè) 重復(fù)。每組玉米秸稈的用量為80mg／mL。

1.3 試驗(yàn)方法 液體培養(yǎng)基參照朱崇淼［6］的配制。NaHCO35.0g、葡萄糖1.0g、酵母膏1.0g、蛋白胨1.0g、緩沖液A 165mL緩沖液B 165mL、無(wú)細(xì)胞瘤胃液170mL、蒸餾水500mL。每1L緩沖液A中含KH2PO43g、NaCl 6g、（NH4）2SO43.9g、CaCl2·2H2O 0.4g、MgSO4·7H2O 0.6g，以蒸餾水作溶劑。每1L緩沖液B中含K2HPO4O3H2O 4 g，以蒸餾水作溶劑。培養(yǎng)基中加入1mL 0.1%刃天青作為厭氧指示劑。上述培養(yǎng)基配制好后通入CO2至飽和（溶液顏色由暗紅色變?yōu)橥该鞯狞S色）后分裝，分裝前半小時(shí)加入0.15%L-半胱胺酸鹽酸鹽。無(wú)細(xì)胞瘤胃液的制備：取新鮮瘤胃液，用雙層紗布過(guò)濾后，在4000r／min離心30min，取離心上清液。

試驗(yàn)用液體培養(yǎng)基則不含有葡萄糖，而是按0.1%添加CMC-Na。

1.4 測(cè)試項(xiàng)目與方法 在發(fā)酵結(jié)束，從各培養(yǎng)瓶中抽取適量發(fā)酵液上清液，測(cè)木聚糖酶活力及纖維素酶活力。將各培養(yǎng)瓶中發(fā)酵液經(jīng)坩堝（坩堝己稱重）真空過(guò)濾，底物殘留及附著的菌體在坩堝中于105℃烘至恒重，計(jì)算底物的干物質(zhì)消失率。木聚糖酶活力和羧甲基纖維素酶活力的測(cè)定均參照文獻(xiàn)［7］。每分鐘每mL酶液釋放1μmol／L木糖（葡萄糖）的酶量為1個(gè)酶活單位（U）。參照張龍翔等［8］主編的生物實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)中的Bradford方法測(cè)定比活力。每分鐘每毫克蛋白釋放1μmol／L木糖（葡萄糖）的酶量定義為1個(gè)酶比活力單位（μ／mg·Protein）。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，并對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果的K和R值進(jìn)行測(cè)定，干物質(zhì)消化率采用Spss Statistics 18軟件進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶 從表1的R值分析可知，影響試驗(yàn)結(jié)果的因素依次為D＞C＞B＞A，即對(duì)木聚糖酶活力的影響因素依次是發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基起始pH值、接種量及N源。從K值可以看出，A1B1C1D1組合木聚糖酶活力最高為8.34U／mL，即 （NH4）2SO4作為N源，接種量為5mL，發(fā)酵起始pH值＝5，發(fā)酵溫度35℃的發(fā)酵組合最佳；A2B2C3D1組合木聚糖酶比活力最高為26.39U／mg。

表1 木聚糖酶活測(cè)定結(jié)果

2.2 羧甲基纖維素酶 從表2的R值分析可知，影響試驗(yàn)結(jié)果的因素依次為A＞B＞D＞C，即對(duì)羧甲基纖維素酶活力的影響因素依次是N源，接種量、發(fā)酵溫度及培養(yǎng)基起始pH值。從K值可以看出，A1B3C3D3組合羧甲基纖維素酶活力最高為0.225U／mL，即 N源為 （NH4）2SO4，接種量為15 mL，培養(yǎng)基起始pH值為7，發(fā)酵溫度39℃的組合酶活力最高，A3B2C1D3組合羧甲基纖維素酶比活力最高為0.253U／mg。

2.3 不同發(fā)酵底物DM降解率 以玉米秸稈為發(fā)酵底物，培養(yǎng)96h后其干物質(zhì)降解率見(jiàn)圖1。干物質(zhì)降解率為34.6%～43.5%，處理4、5組和6組（NH4Cl組）的真菌發(fā)酵干物質(zhì)消失率顯著低于其他各處理組［（NH4）2SO4和尿素組］（P＜0.05）。

表2 羧甲基纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果

圖1 各處理組玉米秸的干物質(zhì)降解率

3 討論

厭氧真菌瘤胃真菌可產(chǎn)生纖維素分解酶、半纖維素分解酶（主要是木聚糖降解酶）、果膠酶、酯酶等13種酶。Lee等［9］曾報(bào)道，瘤胃厭氧真菌產(chǎn)生的木聚糖酶的酶活力比目前工業(yè)用木聚糖酶制劑生產(chǎn)菌米曲霉（Aspergillus oryzae）所產(chǎn)木聚糖酶的酶活力高3倍。朱崇淼等［10］研究厭氧真菌粗酶的木聚糖酶活力為7.89U／mL，劉煥明［11］報(bào)道，黑曲霉p14菌株木聚糖酶最優(yōu)酶活力5.25 U／mL。Tripathi等［12］報(bào)道，12株厭氧真菌的羧甲基纖維素酶活力在160～231mU之間。這些結(jié)果均表明，瘤胃厭氧真菌是迄今所報(bào)道的產(chǎn)酶活力較高的菌株之一。

在試驗(yàn)中，以秸稈為發(fā)酵底物的的木聚糖酶活力為8.34 U／mL，稍低于國(guó)內(nèi)已報(bào)道的鏈霉菌（streptomyces sp.str z-6）所產(chǎn)木聚糖酶活力（9.77 U／mL）［13］。羧甲基纖維酶活力為0.225U／mL，低于孟會(huì)生［14］和于紅霞等［15］報(bào)道的結(jié)果。一方面說(shuō)明在試驗(yàn)條件下，篩選發(fā)酵條件有進(jìn)一步優(yōu)化的可能性，另外一方面對(duì)于纖維素酶活力的檢測(cè)應(yīng)規(guī)范化，以便不同的研究的結(jié)果能有可比性。從發(fā)酵底物的干物質(zhì)消失率看，干物質(zhì)消失率最低的組（4組、5組和6組與木聚糖酶和羧甲基纖維素酶酶活力并不同步，說(shuō)明還存在著沒(méi)有被測(cè)定的纖維素酶，對(duì)纖維素的降解發(fā)揮著作用。5組的最高的木聚糖酶的比活力，進(jìn)一步說(shuō)明，該組的木聚糖酶的純度高，則酶的種類相對(duì)少，在粗纖維降解上并無(wú)優(yōu)勢(shì)。

［1］Deng Y，F(xiàn)ong S S.Influence of culture aeration on the cellulase activity of Thermobifida fusca［J］.Applied Microbiology Biotechnology，2010，85：965-974.

［2］Williams A G，Orpin C G.Polysaeeharide-degrading enzymes formed by three Species of anaerobic fungi grown on a range of carbohydrate substrates［J］.Canadian Journal of Microbiology，1987，33：418-426.

［3］司振書(shū).反芻動(dòng)物對(duì)纖維素的消化機(jī)制［J］.動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)，2004，21（3）：46-48.

［4］Lee S S，Ha J K，Cheng K J.Relative contributions of bacteria，protozoa and fungi to in vitro degradation of orchard grass cell walls and their interactions［J］.Applied and Environmental Microbioloy，2000，66（9）：3807-3813.

［5］趙建亞，周偉琴，郭玉華.反芻動(dòng)物瘤胃真菌在飼料開(kāi)發(fā)上的應(yīng)用［J］.飼料博覽，2004，12：21-23.

［6］朱崇淼，毛勝勇，孫云章，等.產(chǎn)木聚糖酶厭氧真菌菌株篩選及產(chǎn)酶培養(yǎng)條件研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2004，31（3）：11-15.

［7］Lowe S E，Theodorou M K，Trinc A P J.Cellulases and xylanase of anaerobic rumen fungus grown on wheat straw，wheat straw holocellulose，cellulose，and xylan［J］.Applied and Environmental Microbiology，1987，53：1216-1223.

［8］張龍翔，張庭芳，李令媛.生物實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)［M］.北京：高等教育出版社，1997：138-139.

［9］Lee S S，Shin K J，Kim W Y，et al.The rumen ecosystem：as a fountain source of noble enzymes［J］.Asian-Australian Journal of Animal Science，1999，12（6）：988-1001.

［10］朱崇淼.產(chǎn)纖維降解酶厭氧真菌菌株的篩選及其粗酶性質(zhì)的研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士畢業(yè)論文，2003：21-22.

［11］劉煥明，梁運(yùn)祥，吳健.木聚糖酶高產(chǎn)菌株的選育及其產(chǎn)酶條件的研究［J］.中國(guó)釀酒，2008（18）：17-19.

［12］Tripathi V K，Sehgal J P，Puniya A K，et al.Hydrolytic activities of anaerobic fungi from wild blue bull（Boselaphus tragocamelus）［J］.Anaerobe，2007，13：36-39.

［13］孫迅，朱陶，朱啟忠，等.產(chǎn)胞外木聚糖酶放線菌的分離與篩選［J］.微生物學(xué)雜志，1998，18（4）：29-32.

［14］孟會(huì)生，劉衛(wèi)星，洪堅(jiān)平.纖維素分解菌群的篩選組建與羧甲基纖維素酶活力初探［J］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006（1）：27-31.

［15］于紅霞，王利華.酵母膏不同添加量對(duì)瘤胃真菌體外培養(yǎng)的影響［J］.畜牧與獸醫(yī)，2009，9：54-55.