共表達(dá)禽流感HA和NA基因重組雞痘病毒免疫犬的安全性和抗體應(yīng)答

甘軍紀(jì)，李賢舟，張勝文，孟 霞，彭大新，劉秀梵

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

犬常與野鳥(niǎo)、家禽以及動(dòng)物肉產(chǎn)品緊密接觸，增加了禽流感病毒適應(yīng)并傳播給人的可能性。犬自然感染高致病性禽流感（HPAIV）H5N1已有報(bào)道［1］。試驗(yàn)表明，高致病性禽流感（HPAIV）H5N1可以在犬中水平傳播，犬飼喂感染H5N1AIV的禽肉或氣管內(nèi)接種可導(dǎo)致臨床發(fā)病或死亡［2-3］。目前，還沒(méi)有預(yù)防犬流感（H5）的疫苗獲得注冊(cè)［4］。

雞痘病毒（FPV）具有嚴(yán)格的宿主特異性，雖然其不能在哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行生產(chǎn)性復(fù)制，但攜帶外源基因的重組雞痘病毒免疫哺乳動(dòng)物可產(chǎn)生良好的對(duì)表達(dá)外源蛋白的免疫應(yīng)答。近年來(lái)，各種不同的用于哺乳動(dòng)物甚至人的重組禽痘病毒活疫苗試驗(yàn)廣泛展開(kāi)，已有用于預(yù)防馬流感（H3N8）、馬西尼羅病毒、貓狂犬病、犬瘟熱、貓白血病重組禽痘病毒疫苗獲得注冊(cè)［5］。Karaca和Kyriakis等的研究表明，禽流感重組雞痘疫苗（TROVACTM-AIV-H5，美國(guó)）在貓和豬上顯示良好的免疫原性［6-7］。本研究用一個(gè)共表達(dá)H5N1亞型禽流感病毒HA和NA基因的重組雞痘病毒（rFPV-11SH5ANA）免疫犬，評(píng)價(jià)其生物安全性和抗體應(yīng)答。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)犬與SPF種蛋 同窩非免疫家犬6只，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)至9周齡，經(jīng)檢測(cè)無(wú)禽流感（H5N1）、犬瘟熱、犬細(xì)小病毒等抗體。SPF種蛋，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，本實(shí)驗(yàn)室孵化至10日齡，用于繁殖禽流感病毒或制備雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）。

1.2 重組雞痘病毒與禽流感病毒 共表達(dá)H5N1亞型禽流感病毒HA和NA基因的重組雞痘病毒（rFPV-11SH5ANA），本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建［8］。雞痘病毒（FPV，282E4株），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。禽流感病毒（H5N1）G株，本實(shí)驗(yàn)室鑒定和保存。取FPV、rFPV分別接種CEF，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，待80%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)收獲，分裝，于-70℃和37℃凍融3次后，進(jìn)行空斑形成單位（PFU）計(jì)數(shù)［9］。取禽流感病毒（H5N1）G株種毒接種10日齡SPF雞胚，收獲24～48h死亡雞胚尿囊液，小量分裝，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動(dòng)物接種 試驗(yàn)犬分別編號(hào)為犬1～犬6（Dog1～Dog6），隔離飼養(yǎng)。Dog1、Dog2分別皮內(nèi)接種106PFU 的rFPV-11SH5NA。Dog3、Dog4分別皮下接種106PFU的rFPV-11SH5NA。Dog5皮下接種106PFU的FPV，Dog6皮下注射磷酸鹽緩沖液（PBS），作為空白對(duì)照。首次免疫4周后，相同途徑、劑量進(jìn)行第2次接種。

1.4 安全性試驗(yàn) 重組雞痘病毒接種前1d和接種后1～7d，每天觀察接種犬接種部位反應(yīng)（腫脹、疼痛）、精神狀態(tài)，監(jiān)測(cè)體溫（肛溫）；采集抗凝血進(jìn)行全血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，檢測(cè)指標(biāo)按檢測(cè)儀（MINDRAY邁瑞，BC-2800vet）設(shè)定的參考數(shù)據(jù)范圍自動(dòng)判定；采集血清進(jìn)行肌酐（CREA），胰淀粉酶（AMYL），丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT），血糖（GLU）等指標(biāo)測(cè)定，檢測(cè)指標(biāo)按檢測(cè)儀（INDEX，vet Test8008）設(shè)定的參考數(shù)據(jù)范圍自動(dòng)判定。

1.5 血清學(xué)檢測(cè) 試驗(yàn)犬接種重組雞痘病毒前后采血分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。AIV的血清抗體應(yīng)答通過(guò)血凝抑制（HI）試驗(yàn)測(cè)定，按常規(guī)方法進(jìn)行［10］。

2 結(jié)果

2.1 重組雞痘病毒的安全性 試驗(yàn)犬皮內(nèi)和皮下接種重組雞痘病毒（rFPV-11SH5ANA）后，接種部位沒(méi)有明顯紅腫等反應(yīng)，精神狀態(tài)正常。接種后1～7d體溫均在正常值范圍 （＜39.5℃），rFPV第2次重復(fù)接種后，6d內(nèi)體溫也在正常值范圍（＜39.5℃），結(jié)果見(jiàn)圖1。全血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，rFPV接種后1～7d，紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)均在正常范圍內(nèi)；rFPV接種后1～2d，白細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)輕微的下降，第3天起趨于正常（數(shù)據(jù)未列出）。接種（皮內(nèi)、皮下）重組雞痘病毒犬7d內(nèi)部分血清生理生化指標(biāo)平均值（CREA，AMYL，ALT，GLU）與FPV、PBS接種犬之間無(wú)明顯差異，并且均在正常參考值范圍之內(nèi)，見(jiàn)圖2。表明，共表達(dá)H5N1亞型禽流感病毒HA和NA基因的重組雞痘病毒（rFPV-11SH5ANA）接種犬不引起局部和全身性反應(yīng)，對(duì)器官?zèng)]有損害作用，具有高度的安全性。

圖1 試驗(yàn)犬接種重組雞痘病毒（rFPV-11SH5ANA）后的體溫變化。箭頭示第2次接種

2.2 抗體應(yīng)答 禽流感重組雞痘病毒（rFPV-11SH5ANA）1次免疫犬（106PFU）1～4周血清的AIV HI抗體滴度均＜2，rFPV-11SH5ANA 2次接種犬后1～10周，也未檢測(cè)到明顯的AIV HI抗體滴度增加。

圖2 試驗(yàn)犬接種重組雞痘病毒（rFPV-11SH5ANA）、FPV、PBS前后血清部分生化指標(biāo)

3 討論

在家禽上，目前已有表達(dá)高致病性禽流感、新城疫和傳染性喉氣管炎病毒抗原基因的重組雞痘病毒活疫苗獲得注冊(cè)并投入商品應(yīng)用。重組雞痘病毒活疫苗研究中，對(duì)rFPV環(huán)境釋放和對(duì)哺乳動(dòng)物的安全性是疫苗生物安全評(píng)價(jià)的重要方面。過(guò)去的研究表明，禽痘病毒中插入外源基因并沒(méi)有增強(qiáng)重組禽痘病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的毒力。rFPV和rCPV以不同的接種途徑接種小鼠、兔、大鼠、豚鼠、貓、狗、馬、牛和豬沒(méi)有副反應(yīng)［5］。幾個(gè)已注冊(cè)的用于犬、貓的禽痘載體疫苗包括用于貓的金絲雀痘病毒載體狂犬病疫苗、金絲雀痘載體貓白血病疫苗，用于犬的金絲雀痘載體犬瘟熱疫苗，廣泛的應(yīng)用沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的副作用［6］。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，禽流感重組雞痘病毒（rFPV-11SH5ANA）具有良好的生物安全性。

為了預(yù)防伴侶動(dòng)物高致病性禽流感病毒（HPAIV，H5）的感染，Karaca等用表達(dá)H5N8禽流感病毒的H5血凝素基因的重組雞痘病毒（TROVAC AIV-H5）接種貓，產(chǎn)生抗同源H5N8抗原的高水平抗體。第2次接種后，產(chǎn)生的抗體顯示與HPAIV H5N1新分離株有交叉反應(yīng)［6］。Stittelaar等用表達(dá)HPAIV H5HA基因的重組金絲雀痘病毒（ALVAC H5N1）接種SPF貓，有效地保護(hù)了免疫貓對(duì)兩個(gè)不同抗原型的人HPAIV H5N1病毒的氣管內(nèi)攻擊；免疫貓攻毒后排毒顯著減少，說(shuō)明重組金絲雀痘病毒（ALVAC H5N1）接種能有效地減少流感病毒感染貓的病毒傳播［11］。禽流感病毒HI抗體滴度雖然是獲得免疫保護(hù)的一個(gè)重要指標(biāo)，但對(duì)于重組雞痘病毒免疫哺乳動(dòng)物而言細(xì)胞免疫起主要作用，rFPV-11SH5ANA免疫家犬沒(méi)有檢測(cè)到有效的AIV HI抗體應(yīng)答，并不能否定其免疫保護(hù)作用，考慮到生物安全因素，本研究未進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，因此，該重組雞痘病毒免疫犬的保護(hù)效力尚有待進(jìn)一步研究。

［1］Harder T C，Vahlenkamp T W.Influenza virus infections in dogs and cats［J］.Vet Immunol Immunopathol，2010，134：54-60.

［2］Songserm T，Amonsin A，Jam-on R.Fatal avian Influenza A H5N1in a dog［J］.Emerg Infect Dis，2006，12（11），1744-1747.

［3］Maas R，Tacken M，Ruuls L，et al.Avian Influenza（H5N1）susceptibility and receptors in dogs［J］.Emerg Infect Dis，2007，13（8）：1219-1221.

［4］甘軍紀(jì)，劉秀梵.犬貓流感病毒感染與疫苗研究進(jìn)展［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2011，47（2）：45-47.

［5］Poulet H，Minke J，Pardo M C，et al.Development and registration of recombinant veterinary vaccines The example of the canarypox vector platform［J］.Vaccine，2007，25：5606-5612.

［6］Karaca K，Swayne D E，Grosenbaugh D，et al.Immunogenicity of fowlpox virus expressing the avian influenza virus H5 gene（TROVAC AIV-H5）in cats［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2005，12：1340-1342.

［7］Kyriakis C S，Vleeschauwer A D，BarbéF，et al.Safety，immunogenicity and efficacy of poxvirus-based vector vaccines expressing the haemagglutinin gene of a highly pathogenic H5N1 avian influenza virus in pigs［J］.Vaccine ，2009，27：2258-2264.

［8］陳素娟，孫蕾，劉武杰，等.共表達(dá)H5亞型禽流感病毒HA和NA基因的重組雞痘病毒及其免疫效力［J］.微生物學(xué)報(bào)，2006，46（1）：111-114.

［9］甘軍紀(jì)，劉秀梵，彭大新.重組雞痘病毒活疫苗X-gal染色空斑計(jì)數(shù)法的建立［J］.畜牧與獸醫(yī)，2010，42（7）：56-58.

［10］農(nóng)業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：440-442.

［11］Stittelaar K J，Lacombe V，van Lavieren R，et al.Cross-clade immunity in cats vaccinated with a canarypox-vectored avian influenza vaccine［J］.Vaccine，2010，28：4970-4976.