產(chǎn)輔酶Q10大腸桿菌工程菌的構(gòu)建*

李家洲 謝明權(quán) 李安興 羅曉春?

(1．華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006;2．中山大學(xué)水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究所，廣東廣州510275)

輔酶Q(CoQ)，亦稱泛醌，廣泛存在于各種生物膜中，參與多種生命過(guò)程．CoQ的首要功能是參與生物呼吸鏈電子的傳遞，將呼吸過(guò)程所產(chǎn)生的電子由復(fù)合體Ⅰ或復(fù)合體Ⅱ傳遞給復(fù)合體Ⅲ［1］．除此之外，CoQ還有許多其它重要功能．例如，作為還原型煙酰胺腺嘌吟二核苷酸(NADH)氧化酶的輔酶，參與胞質(zhì)中煙酰胺腺嘌吟二核苷酸氧化型與還原型比例(NAD+/NADH)的調(diào)節(jié)，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化［2］;作為高效抗氧化劑阻止細(xì)胞蛋白、脂質(zhì)和DNA被氧化［3］;阻止線粒體膜上大分子轉(zhuǎn)運(yùn)膜打開從而避免線粒體功能損傷［4］等．依據(jù)苯環(huán)上所結(jié)合的聚異戊二烯側(cè)鏈的聚合度，CoQ可分為 CoQ5、CoQ6、CoQ7、CoQ8、CoQ9、CoQ10等．不同物種依據(jù)其固有的遺傳特性，均能合成特定的CoQ．例如，大腸桿菌合成的是 CoQ8［5］;老鼠體內(nèi)合成的是 CoQ9［6］;人體內(nèi)合成的則是CoQ10［7］．CoQ10在人類健康領(lǐng)域展現(xiàn)出非常巨大的市場(chǎng)前景，受到廣泛關(guān)注．CoQ10可作為優(yōu)良的抗氧化劑可消除人體內(nèi)的活性氧［8］．此外，CoQ10還可用于治療心血管疾病［9］、糖尿?。?0］、帕金森氏綜合癥［11］等，也可用于緩解一些抑制素(如促黑激素抑制素、生長(zhǎng)激素抑制素等)的副作用［12］．

目前，CoQ10生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、半合成法和發(fā)酵法，其中發(fā)酵法是目前的主流［13］．發(fā)酵法的關(guān)鍵是選育或構(gòu)建高產(chǎn)CoQ10的菌種．目前可用于生產(chǎn)的菌種均經(jīng)過(guò)誘變育種法得到，包括農(nóng)桿菌、脫氮副球菌和雨生紅球菌等［14］．雖然大腸桿菌具有許多適于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良性能，但由于其合成的是CoQ8，限制了其在商業(yè)生產(chǎn)CoQ10方面的應(yīng)用．現(xiàn)代生物分子學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，使得通過(guò)遺傳改造構(gòu)建適于工業(yè)化生產(chǎn)CoQ10的大腸桿菌的構(gòu)想具備了可行性．

能提供ddsA編碼產(chǎn)物聚十異戊二烯焦磷酸合成酶的微生物包括裂殖酵母(Fission yeast)、脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、紅球菌(Rhodobacter sphroides)、放射型根瘤菌［14］．歷史上放射型根瘤菌曾歸入農(nóng)桿菌屬，后根據(jù)表現(xiàn)型和基因型的差異，將其單列成一個(gè)屬［15］．日本科學(xué)家獲得的CoQ10高產(chǎn)紀(jì)錄(760mg/L)就來(lái)自于放射型根瘤菌［14］，這證明其酶系統(tǒng)具有高產(chǎn)CoQ10的潛力．本研究選擇放射型根瘤菌作為ddsA來(lái)源，將其克隆后通過(guò)同源重組替換大腸桿菌的聚八異戊二烯焦磷酸合成酶基因ispB，并強(qiáng)化CoQ合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，構(gòu)建產(chǎn)CoQ10的大腸桿菌工程菌．

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

DNA標(biāo)準(zhǔn)物、質(zhì)粒抽提試劑盒、凝膠試劑盒、DNA聚合酶、pMD18T載體、限制性內(nèi)切酶和其它DNA修飾酶購(gòu)自大連寶生物有限公司;異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、蛋白酶K和細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自北京普博生物技術(shù)有限公司;L-阿拉伯糖購(gòu)自阿拉丁公司;CoQ10標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;DNA引物由上海生工生物工程有限公司合成;用于高效液相色譜(HPLC)分析的試劑均為色譜純，其它試劑均為分析純．

放射型根瘤菌WSH由江南大學(xué)堵國(guó)成教授饋贈(zèng);其它菌種、pKD3、pKD46、pCP20、pQE30 及其它載體均為華南理工大學(xué)廣東省發(fā)酵與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存或構(gòu)建．

1．2 ddsA 基因克隆

放射型根瘤菌WSH經(jīng)搖床培養(yǎng)［16］，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書從培養(yǎng)液中提取基因組．基因克隆參照文獻(xiàn)［17］．根據(jù)Genebank中Agrobacterium tumefaciens c．58全基因序列中ddsA為參照設(shè)計(jì)上游引物RDup(CGCGGATCCTTGCCGCACAAGGCATCAGTTT，下劃線處為BamHI酶切位點(diǎn))和下游引物RDdown(CGCAAGCTTTCAGTTGAGACGCTCGATGCAG，下劃線處為HindⅢ酶切位`點(diǎn))．利用LA Taq酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，條件為:94℃5min;94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 70s，30 個(gè)循環(huán);72℃5min．PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，凝膠回收純化后進(jìn)行A－T 克隆，構(gòu)建質(zhì)粒 pMD18ddsA，轉(zhuǎn)化 E．coliDH5α，菌落PCR檢測(cè)，送樣測(cè)序．

1．3 大腸桿菌BL21 ispB基因置換

利用大腸桿菌red重組系統(tǒng)，對(duì)大腸桿菌BL21 ispB基因用放射型根瘤菌ddsA基因置換．根據(jù)ispB基因上下游環(huán)境，設(shè)計(jì)上游打靶引物D1(CAGCGATGTGCGCGAGGCCGATGAGTGCTTCTCGCCAAGGGGTGTCCGGGATAGTTCCTATTCCGAAGT，下劃線處為pkD3 Cmr基因引物)和下游打靶引物D2(TGCCTTTGTTCACAGTAAGGTAATCGGGGCGAAAAGCCCGGCTTTTGCGATGCCGCACAAGGCATCA，下劃線處為ddsA上游引物)．打靶片段的下游同源臂為大腸桿菌ispB基因翻譯起始密碼子前面的50 bp序列;上游同源臂為ispB基因翻譯終止密碼子后面的50bp序列．ddsA基因的起始密碼子直接與同源臂相連，保證置換后ddsA的轉(zhuǎn)錄和翻譯不受影響．ddsA與氯霉素抗性基因(Cmr)之間通過(guò) BamHI酶切位點(diǎn)相連．Cmr基因與ddsA基因連接引物p1為CGCGGATCCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAG(下劃線為BamHI位點(diǎn));連接引物p2為CGCGGATCCTCAGTTGAGACGCTCGATGCAG(下劃線為BmaHI位點(diǎn))．以 Primer star為 PCR聚合酶，以 D1和 p1為引物擴(kuò)增pKD3上的Cmr基因;以D2和p2為引物擴(kuò)增質(zhì)粒 pMD18ddsA，條件為:98℃ 1 min;98℃10s，68℃ 70s，30 個(gè)循環(huán);68℃ 5min．PCR 產(chǎn)物分別經(jīng)凝膠純化A－T克隆構(gòu)建質(zhì)粒pMD18HC和質(zhì)粒pMD18HD．之后用 BamHI酶切 pMD18HC，并用堿性磷酸酶處理，回收酶切產(chǎn)物;用 BamHI酶切pMD18HD，凝膠回收帶同源臂的 ddsA片段，與pMD18HC用連接酶連接構(gòu)建質(zhì)粒pMD18HCDH．菌落經(jīng)PCR篩選和測(cè)序驗(yàn)證．經(jīng)過(guò)克隆構(gòu)建出ispB基因置換打靶片段，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1．圖1中，F(xiàn)RT為翻轉(zhuǎn)酶結(jié)合位點(diǎn)的縮寫．

圖1 置換大腸桿菌ispB基因的打靶片段結(jié)構(gòu)Fig．1 Structure of target fragment for substituting Escherichia coli ispB gene

對(duì)驗(yàn)證無(wú)誤的菌落振蕩培養(yǎng)提取質(zhì)粒，用引物D1和D2進(jìn)行PCR，條件同前，制備打靶片段．后續(xù)操作參照文獻(xiàn)［18］進(jìn)行．ispB基因置換利用了大腸桿菌的red重組系統(tǒng)．工具質(zhì)粒pKD46在阿拉伯糖的誘導(dǎo)下合成Exo、Beta、Gam 3種蛋白．Exo結(jié)合在通過(guò)電轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌的同源臂的末端，自5'向3'降解形成單鏈的同源臂末端．Beta蛋白結(jié)合在形成的同源臂單鏈上，引導(dǎo)目的片段ispB的置換重組．Gam抑制RecBCD活性，防止其對(duì)打靶片段的降解．重組后利用打靶片段上的氯霉素抗性標(biāo)記進(jìn)行篩選，再用pCP20質(zhì)粒上的翻轉(zhuǎn)酶重組酶(FLP)結(jié)合在Cmr兩端的FRT位點(diǎn)上，通過(guò)兩位點(diǎn)自身重組，消除掉Cmr基因．其置換過(guò)程見(jiàn)圖2．

圖2 ddsA基因置換大腸桿菌ispB基因的過(guò)程Fig．2 Process of substitution of Escherichia coli ispB with ddsA

用菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，引物為ispB上下游的特異性片段 c1(GACCTTCGCTTACTCGG)和 c2(CCTTCGCAATAATCATCTC);工具酶為 rTaq．反應(yīng)條件為:94℃ 5min;94℃ 30s，44℃ 30s，72℃ 3min，30個(gè)循環(huán);72℃ 5 min．所得2900 bp的片段為陽(yáng)性克隆．

1．4 大腸桿菌 BL21 ubiA、ispA、idi基因克隆及與ddsA串聯(lián)表達(dá)

在CoQ10合成過(guò)程中聚十異戊二烯焦磷酸合成酶、對(duì)羥基苯甲酸聚異戊二烯焦磷酸轉(zhuǎn)移酶、法呢基焦磷酸合成酶、異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶是關(guān)鍵酶．將以上4種關(guān)鍵酶按上述順序依次克隆至pQE30上，在每基因前加上獨(dú)立的SD序列進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21R1，誘導(dǎo)表達(dá)，促進(jìn)CoQ10合成．以大腸桿菌BL21基因組為模板，分別設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增 ubiA、ispA、idi基因，并分別進(jìn)行 A－T克?。甈CR檢測(cè)和測(cè)序鑒定．先將 ddsA克隆到pQE30多克隆位點(diǎn) BamHI和SacI之間構(gòu)建質(zhì)粒pQE30D．并依次將 ubiA、ispA、idi克隆到 pQE30D 多克隆位點(diǎn)的 SacI與 SmaI、SmaI與 PstI、PstI與 HindⅢ之間，每序列前面均帶有核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS，GAAGGAGATATACC)以方便各基因分別翻譯，相應(yīng)地構(gòu)建 pQE30DA、pQE30DAF、pQE30DAFI．各載體的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3．將上述各質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入經(jīng)ddsA置換的大腸桿菌宿主菌內(nèi)，分析其對(duì)CoQ10合成的促進(jìn)作用．

圖3 多酶共表達(dá)體系的構(gòu)建Fig．3 Construction of enzymes co－expression systems

1．5 CoQ10分析

含質(zhì)粒的菌種，振蕩培養(yǎng)至D(600)=0．6后，添加IPTG至0．2 mmol/L繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5 h，檢測(cè)D(600)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成細(xì)胞干重．取50 mL菌液離心收集菌體，加無(wú)菌水清洗一遍，加正已烷3mL，超聲抽提10 min，離心收集上清．重復(fù)抽提一遍，合并兩次上清，減壓蒸餾除去溶劑，加入色譜純乙醇1mL，溶解樣品．用島津Prominence LC－20A檢測(cè)，采用 shodex C18M 4E(250 mm ×4．6 mm)柱，柱溫為32℃，流動(dòng)相乙醇/甲醇體積比為7∶3，流速為1mL/min，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為275nm［19］．

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2．1 ddsA基因的鑒定

以提取的放射型根瘤菌基因組為模板，以引物RDup和RDdown進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條長(zhǎng)度為1100bp左右的片段，經(jīng)A－T克隆，獲得 E．coliDH5α轉(zhuǎn)化體，以相同引物對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖4．

圖4 ddsA A－T克隆的菌落PCR篩選結(jié)果Fig．4 Screening results of ddsA A－T clone by using colony PCR 1—200bp DNA標(biāo)準(zhǔn)物;2－12—樣品

ddsA 基因全長(zhǎng)為1077bp．圖4 中第2、3、5、8、9、10、11泳道均有相應(yīng)PCR條帶，初步判定為陽(yáng)性克隆．為進(jìn)一步確定結(jié)果，隨機(jī)選擇第3、8、10泳道的陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序分析，將結(jié)果在Genebank中進(jìn)行Blast比對(duì)，證明所得片段為放射型根瘤菌ddsA基因．

2．2 ispB基因置換和目標(biāo)重組體的獲得

引物c1位于ispB上游388 bp處，c2位于ispB下游316bp處，ispB全長(zhǎng)942 bp，c1與c2之間相距1675bp．未取代前，以c1與c2為引物的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1675 bp．以打靶片段取代之后，加上氯霉素基因，再以c1與c2為引物進(jìn)行PCR，其產(chǎn)物長(zhǎng)度變成2902 bp．將氯霉素抗性基因消除后，以c1與c2為引物進(jìn)行PCR的產(chǎn)物長(zhǎng)度為1900 bp左右(包含由于氯霉素抗性基因消除時(shí)留下的一個(gè)FRT位點(diǎn))．以c1與c2為引物，分別以替代前、替代后帶Cmr、替代后不帶Cmr的基因組為模板進(jìn)行PCR，所得結(jié)果見(jiàn)圖5．

圖5 大腸桿菌BL21 ispB基因替代前后的PCR鑒定Fig．5 PCR identification of Escherichia coli BL21 ispB before and after substitution

圖5中ispB基因替代前后的PCR結(jié)果符合預(yù)期．為進(jìn)一步確證，將替代后Cmr消除前的PCR產(chǎn)物送樣測(cè)序．其基因序列結(jié)構(gòu)與設(shè)計(jì)一致，表明ddsA基因置換ispB成功．

2．3 重組大腸桿菌的CoQ10合成

菌落PCR為陽(yáng)性的克隆，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，用HPLC分析CoQ的種類，結(jié)果見(jiàn)圖6．圖6(a)－(c)示出了標(biāo)準(zhǔn)CoQ10、ispB未置換的大腸桿菌BL21(DE3)中所含的CoQ8、ispB被ddsA置換后大腸桿菌BL21所含的CoQ種類(包括CoQ9和CoQ10)．通過(guò)對(duì)比圖6(b)和(c)可以證明ispB已被ddsA成功置換，故不再具有CoQ8合成能力．放射型根瘤菌的ddsA在大腸桿菌中，除了可以合成CoQ10外還合成CoQ9，這與文獻(xiàn)［19］的報(bào)道一致．筆者已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這種合成的非特異性由菌體培養(yǎng)環(huán)境引起(結(jié)果將在另一篇文章刊出)．這一結(jié)果同時(shí)證明，在大腸桿菌中，CoQ10完全可以替代 CoQ8的功能，不影響大腸桿菌的正常代謝．但各CoQ6－10種類之間，是否都可以完全相互替代，則還需要進(jìn)一步證明．

圖6 ispB被ddsA替代前后CoQ的HPLC檢測(cè)Fig．6 HPLC detection of CoQ of Escherichia coli before and after substituting ispB with ddsA

2．4 多酶共表達(dá)促進(jìn)CoQ10合成

根據(jù)文獻(xiàn)［19］的報(bào)道，在CoQ10的合成體系中ddsA、ubiA、ispA、idi 4 種酶為關(guān)鍵酶．其中 ddsA 基因產(chǎn)物為聚十異戊二烯焦磷酸合成酶，催化CoQ10的側(cè)鏈聚十異戊二烯焦磷酸;ubiA基因產(chǎn)物為對(duì)羥基苯甲酸聚異戊二烯焦磷酸轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)將聚異戊二烯連接到對(duì)羥基苯甲酸苯環(huán)的第3位碳原子上;ispA基因產(chǎn)物為法呢基焦磷酸合成酶，催化合成聚十異戊二烯焦磷酸合成的前體;idi的基因產(chǎn)物為異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶，將異戊二烯焦磷酸異構(gòu)為二甲基烯丙基焦磷酸，后者為異戊二烯焦磷酸聚合的引導(dǎo)物．對(duì)于CoQ的合成代謝調(diào)節(jié)機(jī)理，目前依然知之甚少．

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，pQE30是表達(dá)放射型根瘤菌ddsA的良好載體．其它研究者雖然有利用pET32、pET28和pUC18作載體成功表達(dá)其它物種ddsA 的例子［20－22］，但在本實(shí)驗(yàn)中，用上述載體表達(dá)的酶均為包涵體，不能用于促進(jìn)CoQ10的合成．這可能與不同來(lái)源ddsA的表達(dá)產(chǎn)物折疊時(shí)的難易不同有關(guān)．放射型根瘤菌聚十異戊二烯合成酶(DPS)在折疊時(shí)相對(duì)困難，因此在用強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)時(shí)，表達(dá)速度太快，使產(chǎn)物來(lái)不及形成正確的折疊．用啟動(dòng)能力相對(duì)較弱的pQE30時(shí)則不存在這個(gè)問(wèn)題，可以形成正確的折疊，故本實(shí)驗(yàn)選用pQE30作載體．

將上述構(gòu)建的各表達(dá)體系轉(zhuǎn)入E．coli BL21R1，經(jīng)菌落PCR鑒定獲得陽(yáng)性克隆，接種入50mL LB培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)檢測(cè)其CoQ10合成能力，結(jié)果見(jiàn)表1．

表1 各工程菌CoQ10合成情況Table 1 Results of all recombinants for CoQ10production

從表1中可以看出，隨著表達(dá)酶種類的增多，細(xì)胞干重呈下降趨勢(shì)．這主要是因?yàn)?，隨表達(dá)酶數(shù)量的增加，菌體所承受的負(fù)擔(dān)增加，使菌體生長(zhǎng)速度下降所致．同時(shí)，隨表達(dá)酶種類的增多，干菌體中CoQ10含量增加，其中帶有 pQE30D、pQE30DA、pQE30DAF、pQE30DAFI的BL21R1相對(duì)不帶質(zhì)粒的BL21R1分別提高 38．5%、86．5%、117．3%、126．9%．按構(gòu)建順序進(jìn)行前后比較，CoQ10提高幅度由高到低分別為pQE30DA(48．0%)、pQE30D(38．5%)、pQE30DAF(30．8%)、pQE30DAFI(9．6%)．ddsA 催化合成的產(chǎn)物為ubiA的底物，在強(qiáng)化ddsA的前提下，強(qiáng)化ubiA比不強(qiáng)化ubiA時(shí)的CoQ10的產(chǎn)量提高幅度高，表明在強(qiáng)化ddsA的前提下，ubiA是CoQ10合成的瓶頸．綜合而言，ddsA與ubiA對(duì)CoQ10產(chǎn)量影響較大，為關(guān)鍵基因;ispA與idi對(duì)CoQ10產(chǎn)量影響較小，為次關(guān)鍵基因．最終得到的 E．coli BL21R1 pQE30－DAFI的 CoQ10合成能力相對(duì)于出發(fā)菌株提高了1．269倍．

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)將大腸桿菌ispB置換為放射型根瘤菌ddsA，使合成CoQ8大腸桿菌可以合成CoQ10，證明CoQ10可代替大腸桿菌中CoQ8的功能．通過(guò)強(qiáng)化CoQ10合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶 ddsA、ubiA、ispA、idi等，可以使大腸桿菌CoQ10合成能力由出發(fā)菌株的(0．52±0．03)mg/g(干菌體)，提高至(1．18 ±0．02)mg/g(干菌體)，提高幅度達(dá)126．9%．大腸桿菌遺傳背景清晰，代謝簡(jiǎn)單，安全性好，生長(zhǎng)迅速，被廣泛用于構(gòu)建多種工業(yè)生產(chǎn)菌種，但到目前為止，還未成功構(gòu)建用于生產(chǎn)CoQ10的菌種．可能的原因是對(duì)大腸桿菌中與CoQ合成相關(guān)的一些機(jī)制還未完全了解．因此，為利用大腸桿菌生產(chǎn)CoQ10，需要進(jìn)一步研究其調(diào)節(jié)機(jī)制，才能最終實(shí)現(xiàn)突破．

［1］ Ernster L，Dallner G．Biochemical，physiological and medical aspects of ubiquinone function ［J］．Biochimica et Biophysica Acta，1995，1271(1):195－204．

［2］ Consuelo Gormez－Diaz，Juan Carlos Rodriguez－Aguilera，Maria P Barroso，et al．Antioxidant ascorbate is stabilized by NADH－coenzyme Q10ruductase in the plasma membrane［J］．Journal of Bioenergetics and Biomembranes，1997，29(3):251－257．

［3］ David Petillo，Herbert O Hultin．Ubiquinone－10 as an antioxidant［J］．Journal of Food Biochimistry，2008，32(2):173－181．

［4］ Laura Papucci，Nicola Schiavone，Ewa Witort，et al．Coenzyme Q10prevents apoptosis by inhibiting mitochondrial depolarization independently of its free radical scavenging property［J］．The Journal of Biological Chemistry，2003，278(30):28220－28228．

［5］ Kwon O，Kotsakis A，Meganathan R．Ubiquinone(coenzyme Q)biosynthesis in Eshcherichia coli:identification of the ubiF gene［J］．FEMS Microbiology Letters，2000，186(2):157－161．

［6］ Michael Tekle，Magnus Bentinger，Tomas Nordman，et al．Ubiquinone biosynthesis in rat liver peroxisomes［J］．BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，2002，291(5):1128－1133．

［7］ Daniel J M Fernández－Ayala，Guillermo López－Lluch，Macarena García－Valdés，et al．Specificity of coenzyme Q10for a balanced function of respiratory chain and endogenous ubiquinone biosynthesis in human cells［J］．Biochimica et Biophysica Acta，2005，1706(1/2):174－183．

［8］ Magnus Bentinger，Kerstin Brismar，Gustav Dallner．The antioxidant role of coenzyme Q［J］．Mitochondrion，2007，7(S):S41－S50．

［9］ Muralikrishnan Dhanasekaran，Jun Ren．The emerging role of coenzyme Q－10 in aging，nerodegeration，cardiovascular disease，cancer and diabetes mellitus［J］．Current Neurovascular Research，2005，2(5):447－459．

［10］ Hodgson J M，Wattsi G F，Playford D A，et al．Coenzyme Q10improves blood pressure and glycaemic control:a controlled trial in subjects with type 2 diabetes［J］．European Journal of Clinical Nutrition，2002，56(11):1137－1142．

［11］ Clifford W Shults，David Oakes，Karl Kieburtz，et al．Effects on coenzyme Q10in early Parkinson disease:evidence of slowing of the functional decline［J］．Archives of Neurology，2002，59(10):1541－1550．

［12］ Giuseppe Caso，Patricia Kelly，Margaret A McNurlan，et al．Effect of coenzyme Q10on myopatic symptoms in patients treated with statins［J］．American Journal of Cardiology，2007，99(10):1409－1412．

［13］ Jeya Marimuthu，Moon Hee－Jung，Lee Jeong－Lim，et al．Current state of coenzyme Q10production and its applications［J］．Applied Microbiology Biotechnology，2010，85(6):1653－1663．

［14］ Hajime Yoshida，Yukinobu Kotani，Keiko Ochiai，et al．Production of ubiquinone－10 using bacteria ［J］．The Journal of General and Applied Microbiology，1998，44(1):19－26．

［15］ Yong J M，Kuykendall L D，Martínez－Romero E，et al．Classification and nomenclature of Agrobacterium and Rhizobium－a reply to Farraad et al(2003) ［J］．International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2003，53(4):1689－1695．

［16］ 潘春梅，劉暢，堵國(guó)成．放射型根瘤菌輔酶Q10發(fā)酵助劑的研究［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(10):13－16．Pan Chun－mei，Liu Chang，Du Guo－cheng．Studies on the promotor of CoQ10fermentation with Rhizobium radiobacter［J］．Food and Fermentation Industries，2005，31(10):13－16．

［17］ 郭成栓，崔堂兵，郭勇．β－1，4－葡聚糖內(nèi)切酶基因的克隆及表達(dá)［J］．華南理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008，36(12):112－115，145．Guo Cheng－shuan，Cui Tang－bing，Guo Yong．Cloning and expression of β－1，4－endoglucanase gene ［J］．Journal of South China University of Technology:Natural Science Edition，2008，36(12):112－115，145．

［18］ Kirill A Datsenko，Barry L Wanner．One－step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K－12 using PCR products［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，2000，97(12):6640－6645．

［19］ Seiji Takahashi，Tokuzo Nishino，Tanetoshi Koyama．Isolation and expression of Paracoccus denitrificans decaprenyl diphosphate synthase gene for production of ubiquinone－10 in Escherichia coli［J］．Biochemical Engineering Journal，2003，16(2):183－190．

［20］ Seo M J，Im E M，Nam J Y，et al．Increase of CoQ10production level by the coexpression of decaprenyl diphosphate synthase and 1－deoxy－D－xylulose 5－phosphate isolated from Rhizobium radiobacter ATCC4718 in recombinant Escherichia coli［J］．Journal of Microbiology and Biotechnology，2007，17(6):1045－1048．

［21］ Liu Xinyi，Wu Haizhen，Ye Jiang，et al．Cloning and characterization ofddsA gene encoding decaprenyl diphosphate synthase from Rhodobacter capsulatus B10［J］．Canadian Journal of Microbiology，2006，52(12):1141－1147．

［22］ Kazunori Okada，Tomohiro Kainou，Kasunori Tanka，et al．Molecular cloning and mutational analysis of the ddsA gene encoding decaprenyl diphosphate synthase from Gluconobacter suboxydans［J］．European Journal of Biochemistry，1998，255(12):52－59．