重組畢赤酵母細(xì)胞壁蛋白的抽提和分析*

林影 周新瑩 韓雙艷 張莉 葉燕銳 鄭穗平

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006)

巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)作為一種甲醇營養(yǎng)型酵母具有很多優(yōu)點(diǎn)，已有數(shù)百種外源蛋白實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母中的高效表達(dá)［1-2］.巴斯德畢赤酵母細(xì)胞在甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)響應(yīng)細(xì)胞變小，細(xì)胞壁增厚［3］.筆者對(duì)甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母外源蛋白表達(dá)的RNA-Seq與數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明:61個(gè)預(yù)測(cè)的畢赤酵母糖基化磷脂酰肌醇(GPI)細(xì)胞壁蛋白基因中，有24個(gè)基因的表達(dá)水平(RPKM)大于全基因表達(dá)的平均水平(約為130)，其中:11個(gè)預(yù)測(cè)的GPI蛋白基因的表達(dá)水平在前5%，表達(dá)量最高的GPI細(xì)胞壁蛋白基因PAS_chr1-4_0586的 RPKM值高達(dá)14977，在所有基因表達(dá)水平中排第2位，該蛋白已被確證為GPI型細(xì)胞壁錨定蛋白［4］.這一研究結(jié)果引起筆者研究畢赤酵母細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組的極大興趣.

近年來，研究方法和技術(shù)的提升已為微生物細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組學(xué)的研究打開了一扇大門［5］.酵母已成為真核微生物細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要對(duì)象，如:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)［6］、白假絲酵母(Candida albicans)以及光滑假絲酵母(Candida glabrata)等［7-9］，這些酵母細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組分析為致病菌病源發(fā)生機(jī)制及致病靶蛋白的研究提供了基礎(chǔ).工業(yè)微生物蛋白質(zhì)組學(xué)及細(xì)胞器蛋白質(zhì)組研究的深入展開，為微生物代謝調(diào)控的研究提供了幫助［10］.de Groot等［11］對(duì)粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)細(xì)胞壁共價(jià)鍵結(jié)合蛋白的質(zhì)譜分析研究表明，S.pombe細(xì)胞壁結(jié)合蛋白含豐富的GPI壁蛋白和堿敏感壁蛋白.

文獻(xiàn)［12］報(bào)道了乳酸克魯維斯酵母(Kluyveromyces lactis)細(xì)胞壁蛋白組的研究結(jié)果，其與P.pastoris為相似的Crabtree-negative酵母.Qing等［13］對(duì)釀酒酵母19種共價(jià)結(jié)合的細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定和分析，其中包括12種GPI型、4種蛋白內(nèi)部重復(fù)(PIR)型以及3種類似PIR型的細(xì)胞壁蛋白.Castillo等［7］對(duì)白色念珠菌中21種細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行蛋白組學(xué)分析和討論，其中19種為GPI型共價(jià)結(jié)合方式，并確定了其中某些細(xì)胞壁蛋白的功能.

據(jù)報(bào)道，酵母細(xì)胞表面的性質(zhì)主要是由細(xì)胞壁的甘露糖蛋白決定的［14］，穩(wěn)定的細(xì)胞壁蛋白(CWPs)提取方法是細(xì)胞壁蛋白組研究的關(guān)鍵一步，常用的細(xì)胞壁甘露糖蛋白的抽提方法有:(1)熱十二烷基磺酸鈉(SDS)或β-巰基乙醇/二硫蘇糖醇(DTT)等還原性試劑抽提法，主要用于抽提由氫鍵等非共價(jià)或二硫鍵連接細(xì)胞壁的甘露糖蛋白，如釀酒酵母絮凝素Flo1p［15］;(2)昆布多糖酶可水解提取與細(xì)胞壁葡聚糖通過共價(jià)鍵相連的細(xì)胞壁甘露糖蛋白，包括GPI型和PIR型兩種不同類型的甘露糖蛋白［16］; (3)氫氟酸吡啶(HF-pyridine)可用于抽提GPI型壁蛋白(GPI-CWPs)，主要作用為切斷GPI錨中的磷酸二酯鍵［14］;(4)溫和堿處理可以抽提PIR型細(xì)胞壁甘露糖蛋白(PIR-CWPs)［17］.但是，上述方法主要針對(duì)不同微生物細(xì)胞分別建立，未能比較討論這些方法的適用范圍及提取效果.并且不同酵母細(xì)胞及其在不同生理?xiàng)l件下的細(xì)胞壁蛋白的組成和結(jié)構(gòu)均存在較大的差異.

為探索穩(wěn)定和可靠的各種畢赤酵母細(xì)胞壁蛋白的提取方法，本研究以含非共價(jià)結(jié)合型細(xì)胞壁蛋白的重組酵母GS115/KFS-CALB、共價(jià)結(jié)合型GPI壁蛋白重組酵母GS115/KNS-CALB以及共價(jià)結(jié)合型PIR壁蛋白重組酵母GS115/Pir1-CALB為研究對(duì)象，建立適用畢赤酵母不同錨定方式的細(xì)胞壁蛋白的有效提取方法，以期為畢赤酵母細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步研究提供技術(shù)支持.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

基于Flo1p絮凝素錨定系統(tǒng)的重組畢赤酵母GS115/KFS-CALB、α凝集素錨定系統(tǒng)GS115/KNSCALB、Pir1壁蛋白錨定系統(tǒng)GS115/Pir1-CALB，均由華南理工大學(xué)微生物酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存.主要試劑有:昆布多糖酶、氫氟酸吡啶、去N糖基化酶、蛋白酶抑制劑混合物、C4底物，均購自廣州瑞斯生物有限公司.

1.2 方法

1.2.1 重組畢赤酵母的培養(yǎng)

將構(gòu)建的重組畢赤酵母接種于酵母甘油培養(yǎng)基(BMGY)的500mL搖瓶中，裝液量為10%，28℃下250r/min培養(yǎng)16～18h至D(600)=5.用滅菌離心管在室溫下3000 g離心5 min收集細(xì)胞，酵母甲醇培養(yǎng)基(BMMY)重懸細(xì)胞至D(600)=1時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo).每24h加甲醇至終濃度為1%，直至最佳誘導(dǎo)時(shí)間.取D(600)=40時(shí)的酵母進(jìn)行細(xì)胞壁蛋白抽提.

1.2.2 免疫熒光顯微鏡分析

將表面結(jié)合有重組蛋白的畢赤酵母用IX71型熒光顯微鏡(上海精科雷磁實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn))觀察，具體方法見文獻(xiàn)［18］.

1.2.3 脂肪酶酶活測(cè)定

檢測(cè)重組畢赤酵母表面及細(xì)胞培養(yǎng)上清的脂肪酶酶活，具體方法見文獻(xiàn)［19］.

1.2.4 細(xì)胞壁分離

將收集的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞壁的分離，具體方法見文獻(xiàn)［19］.

1.2.5 細(xì)胞壁甘露糖蛋白的抽提

將上述分離的GS115/KFS-CALB、GS115/KNSCALB和 GS115/Pir1-CALB的細(xì)胞壁中均加入600μL的SDS緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH= 7.8)、100mmol/L EDTA、2%SDS、40mmol/L β-巰基乙醇)，100℃煮沸20 min，常溫下14000 r/min離心10min，上清即SDS法抽提的細(xì)胞壁蛋白［15］.沉淀用上述緩沖液洗滌3次，加入60 μL乙酸鈉緩沖液(pH=5.5)，再加入約0.2U昆布多糖酶，于37℃培養(yǎng)箱孵育4 h或過夜，常溫下14 000 r/min離心10min，上清即昆布多糖酶法抽提的細(xì)胞壁蛋白［16］.將SDS抽提之后的沉淀洗滌之后，加入70μL氫氟酸吡啶混勻，于0℃孵育3h，14000r/min離心10min，取上清，加入630 μL 100%甲醇緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH=7.8，溶于100%甲醇溶質(zhì)中)析出壁蛋白，再于0℃孵育2 h，14000 r/min離心10 min去除上清，沉淀用90%甲醇緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH=7.8，溶于90%甲醇溶質(zhì)中)洗滌3次之后，加入2%SDS上樣緩沖液，用于SDS-PAGE分析，即為氫氟酸吡啶法抽提的細(xì)胞壁蛋白［14］.若將SDS抽提之后的沉淀洗滌之后加入30 mmol/L NaOH溶液，于4℃孵育17h，然后以14000r/min離心10min，取上清則為溫和堿法抽提的細(xì)胞壁蛋白［18］.

1.2.6 壁蛋白去糖基化處理

細(xì)胞壁蛋白提取液于糖蛋白變性緩沖液(含5%SDS，400 mmol/L二硫蘇糖醇)中100℃煮沸10min使糖蛋白變性.再在加入1%NP-40的1×G7反應(yīng)緩沖液(50mmol/L磷酸鈉，pH=7.5，25℃)的去N糖基化酶中于37℃溫育，所得樣品即可用于后續(xù)的酶切反應(yīng).

1.2.7 融合壁蛋白SDS-PAGE和Western Blot分析

將上述用各種方法抽提的細(xì)胞壁重組蛋白以及去除N糖基化的樣品用SDS-PAGE分析，采用半干轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad)，進(jìn)行Western Blot鑒定，4℃封閉過夜后，用與Flag標(biāo)簽反應(yīng)的一抗(1∶1000)Rabbit anti-FLAG IgG抗血清孵育2h，再于結(jié)合了辣根過氧化物酶的二抗(1:5000)Goat anti-rabbit中孵育1 h.經(jīng)過曝光、顯影和定影后，可得特異性結(jié)合抗體的融合壁蛋白.

2 結(jié)果

2.1 融合壁蛋白在畢赤酵母細(xì)胞表面的展示

對(duì)畢赤酵母表面3種不同類型的細(xì)胞壁蛋白(絮凝功能域結(jié)合型、GPI共價(jià)結(jié)合型、PIR共價(jià)結(jié)合型)進(jìn)行了研究，利用畢赤酵母表面展示系統(tǒng)將攜帶Flag標(biāo)簽的報(bào)告蛋白南極假絲酵母脂肪酶B (CALB)分別與上述壁蛋白融合，運(yùn)用免疫熒光顯微鏡技術(shù)鑒定外源蛋白，描述融合壁蛋白錨定于畢赤酵母表面的情況.

將非共價(jià)結(jié)合型酵母GS115/KFS-CALB、GPI共價(jià)結(jié)合型酵母GS115/KNS-CALB、PIR共價(jià)結(jié)合型酵母GS115/Pir1-CALB于BMMY中搖瓶培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)120h取樣，采用免疫熒光顯微鏡對(duì)其進(jìn)行鑒定.以宿主菌 P.pastoris GS115為空白對(duì)照，鼠源Flag單克隆抗體作為一抗，Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，在波長為492 nm的激光下激發(fā)，520nm波長處有吸收峰.經(jīng)免疫熒光顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組畢赤酵母GS115/KFS-CALB、GS115/ KNS-CALB、GS115/Pir1-CALB細(xì)胞壁表面均產(chǎn)生綠色熒光，宿主菌P.pastoris GS115表面無熒光產(chǎn)生(見圖1).表明3種類型融合壁蛋白(非共價(jià)結(jié)合型、GPI共價(jià)結(jié)合型、PIR共價(jià)結(jié)合型)已成功地展示于畢赤酵母細(xì)胞壁的表面.

圖1 帶標(biāo)記重組畢赤酵母的熒光顯微照片F(xiàn)ig.1 Fluorescence microscope images of labeled recombinant Pichia Pastoris

2.2 重組畢赤酵母生長與融合蛋白的表達(dá)

將含有報(bào)告蛋白CALB的重組畢赤酵母GS115/ KFS-CALB、GS115/KNS-CALB和 GS115/Pir1-CALB接種于BMMOL/LY搖瓶中培養(yǎng)，觀察重組酵母的生長情況和融合蛋白的表達(dá)，融合蛋白的表達(dá)量用CALB酶表達(dá)量表征，以宿主菌P.pastoris GS115為空白對(duì)照.結(jié)果見圖2(a)，隨時(shí)間增加，菌體D(600)值也逐漸增加;甲醇誘導(dǎo)72h之后，菌體呈平穩(wěn)增加的趨勢(shì).

圖2 重組畢赤酵母生長曲線及酶活曲線Fig.2 Growth and enzymic activity curves of recombinant Pichia Pastoris

甲醇誘導(dǎo)后，3種重組畢赤酵母菌體表面均存在CALB水解酶活性，并且隨著時(shí)間的增加而增強(qiáng)，尤其在誘導(dǎo)的48～96h之間，單位水解酶活性增加幅度最大，96h之后則增速減緩(見圖2(b)).其中，雖然同一種融合脂肪酶以同一種畢赤酵母作為宿主，但是融合壁蛋白的差異卻使脂肪酶在酵母表面的展示效果存在很大差別，這與張溪等［19］的研究結(jié)果一致.菌體生長趨勢(shì)幾乎相同的3種重組菌中，PIR共價(jià)結(jié)合型酵母GS115/Pir1-CALB菌體的脂肪酶水解比酶活最低，其最高值達(dá)到210.47 U/g(以干細(xì)胞計(jì)，余同);非共價(jià)結(jié)合型酵母GS115/KFS-CALB和GPI共價(jià)結(jié)合型酵母GS115/KNS-CALB菌體的脂肪酶水解比酶活在誘導(dǎo)后各個(gè)時(shí)段均比GS115/Pir1-CALB高，最高值分別達(dá)855.02 U/g和1239.40 U/g.張溪等［19］的研究結(jié)果也表明，GS115/KFS-CALB的菌體表面酶活力較GS115/KNS-CALB低，推測(cè)可能是錨定蛋白結(jié)合細(xì)胞壁的能力有所不同引起的.

上述結(jié)果表明，用畢赤酵母不同結(jié)合類型的錨定蛋白展示脂肪酶，對(duì)細(xì)胞的生長狀況影響不大，而對(duì)展示酶的表達(dá)量存在較大影響.

2.3 畢赤酵母細(xì)胞壁蛋白的抽提

為穩(wěn)定有效地獲取畢赤酵母不同類型的細(xì)胞壁蛋白，研究了畢赤酵母細(xì)胞有效破碎的條件，經(jīng)試驗(yàn)確定每毫升酵母細(xì)胞壁破碎使用的玻璃珠量為730mg，在常溫下，破碎30s后間隔1min作用8次，細(xì)胞破碎率達(dá)98.3%.離心收集細(xì)胞壁碎片，分別采用改進(jìn)的熱SDS抽提法、昆布多糖酶抽提法、氫氟酸吡啶抽提法和溫和堿抽提法提取細(xì)胞壁甘露糖蛋白(如圖3所示)，利用SDS-PAGE和Western Blot技術(shù)對(duì)各種抽提法獲得的重組壁蛋白進(jìn)行分析.

圖3 畢赤酵母細(xì)胞壁蛋白抽提流程示意圖Fig.3 Schematic diagram of the extraction procedure of cell wall proteins of Pichia Pastoris

從圖4中各圖上部分SDS-PAGE電泳圖中蛋白條帶的深淺可以判斷各種方法抽提等量的酵母細(xì)胞壁蛋白的效率，通過比較發(fā)現(xiàn):熱SDS法能較有效地抽提非共價(jià)鍵結(jié)合壁蛋白，昆布多糖酶法能較有效地抽提共價(jià)鍵結(jié)合的細(xì)胞壁蛋白(GPI型和PIR型);而氫氟酸吡啶法和溫和堿的抽提效率相對(duì)較低，這將會(huì)直接影響畢赤酵母細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組的分離效率，可能造成低豐度壁蛋白的提取困難.因此，熱SDS抽提法和昆布多糖酶抽提法可作為進(jìn)一步的畢赤酵母細(xì)胞壁蛋白質(zhì)組研究的基本方法.

圖4 重組畢赤酵母細(xì)胞壁蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.4 SDS-PAGE and Western blot analysis of cell wall proteins of recombinant Pichia Pastoris M—蛋白標(biāo)準(zhǔn)物;K—昆布多糖酶法;W—溫和減法; Q—?dú)浞徇拎し?S—熱SDS法;T—去N糖基化

結(jié)果顯示(見圖4各圖下部分):在含2%SDS的抽提緩沖液中，非共價(jià)結(jié)合型酵母GS115/KFSCALB煮沸10min處理，得到表觀相對(duì)分子質(zhì)量為200000的細(xì)胞壁蛋白;在氫氟酸吡啶溶液中，GPI共價(jià)結(jié)合型酵母GS115/KNS-CALB冰浴3 h處理，得到相對(duì)分子質(zhì)量為200 000的細(xì)胞壁蛋白;在30mmol/L的NaOH中，PIR共價(jià)結(jié)合型酵母GS115/ Pir1-CALB于4℃過夜處理，得到相對(duì)分子質(zhì)量為100000的細(xì)胞壁蛋白;在昆布多糖酶溶液中，GS115/KNS-CALB、GS115/Pir1-CALB于37℃孵育4h，則可分別得到相對(duì)分子質(zhì)量分別為200000和100000的細(xì)胞壁蛋白，而其它抽提方法得到的相應(yīng)細(xì)胞壁蛋白則無法由蛋白印跡鑒定到目的蛋白.

由此說明，熱SDS可以抽提畢赤酵母GS115/ KFS-CALB非共價(jià)結(jié)合型的細(xì)胞壁蛋白Flo1p;氫氟酸吡啶和溫和堿可分別釋放GS115/KNS-CALB中GPI型共價(jià)結(jié)合細(xì)胞壁蛋白 α凝集素和 GS115/ Pir1-CALB中PIR型共價(jià)結(jié)合細(xì)胞壁蛋白Pir1;而昆布多糖酶可同時(shí)釋放畢赤酵母GS115/KNS-CALB、GS115/Pir1-CALB中兩種共價(jià)結(jié)合類型(GPI型和PIR型)的細(xì)胞壁蛋白α凝集素和Pir1.

2.4 畢赤酵母細(xì)胞壁蛋白的糖基化

在建立酵母不同類型細(xì)胞壁蛋白抽提方法的過程中，抽提得到的重組蛋白表觀相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)測(cè)值不一致，去除N糖基化后相對(duì)分子質(zhì)量有所減小，說明3類錨定蛋白存在N糖基化且N糖基化程度不同，這為深入研究不同壁蛋白糖基化的原理奠定了基礎(chǔ).

重組畢赤酵母GS115/KFS-CALB、GS115/KNSCALB、GS115/Pir1-CALB的重組蛋白分別由1191、967、658個(gè)氨基酸組成，其預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量分別是131 000、106 000、72 000.SDS-PAGE和 Western blot鑒定結(jié)果(見圖4)表明，不同抽提方法得到重組蛋白的表觀相對(duì)分子質(zhì)量均比預(yù)測(cè)值高出很多，這與之前的報(bào)道一致［18］.

為分析造成重組蛋白表觀相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)測(cè)值之間差異的原因，本研究利用去N糖基化酶PNGase F，將不同方法抽提的重組細(xì)胞壁蛋白去除N糖基化，以此初步分析其糖基化狀況(見圖4).經(jīng)SDS-PAGE及Western Blot鑒定，發(fā)現(xiàn)去除N糖基化后，重組蛋白表觀相對(duì)分子質(zhì)量比之前有所減小，但并不明顯，說明這3種類型重組蛋白均存在較小程度的N糖基化.這與Tanino等［20］的研究結(jié)果相似.重組畢赤酵母GS115/KFS-CALB、GS115/KNS-CALB和GS115/Pir1-CALB的細(xì)胞壁蛋白去除N糖基化之后，表觀相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)測(cè)值還存在差異，O糖基化修飾作用可能是引起其表觀相對(duì)分子質(zhì)量增加的一個(gè)原因.

3 結(jié)語

本研究以重組非共價(jià)結(jié)合壁蛋白酵母GS115/ KFS-CALB、重組GPI共價(jià)結(jié)合壁蛋白酵母GS115/ KNS-CALB和重組PIR共價(jià)結(jié)合壁蛋白酵母GS115/ Pir1-CALB為研究對(duì)象，對(duì)不同方式結(jié)合于酵母細(xì)胞壁的重組畢赤酵母細(xì)胞壁蛋白的抽提效果進(jìn)行分析，結(jié)果表明，熱SDS法可有效地抽提畢赤酵母非共價(jià)鍵結(jié)合壁蛋白，昆布多糖酶法可有效地抽提畢赤酵母共價(jià)鍵結(jié)合壁蛋白.由此可見，借助文中提供的熱SDS抽提法和昆布多糖酶抽提法對(duì)細(xì)胞壁蛋白進(jìn)行抽提分類，進(jìn)一步結(jié)合高分辨率液相色譜和質(zhì)譜分析技術(shù)，可有效和特異地鑒定畢赤酵母細(xì)胞壁蛋白組成，進(jìn)而分析其功能.

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