金雀異黃酮預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠小腦浦肯野細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

趙士弟 黃 麗 姜之全 姜麗娜 王小嬌 陳前芬 (蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030)

藥物預(yù)處理是否具有腦保護(hù)作用，報(bào)道并不多見。金雀異黃酮(GEN)是大豆異黃酮的主要活性成分，為一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)、抗氧化劑和酪氨酸蛋白激酶抑制劑。GEN對(duì)腫瘤、骨質(zhì)疏松、心血管等疾病的防治作用已有報(bào)道〔1〕，且GEN可促進(jìn)腦缺血組織的海馬神經(jīng)的再生〔2〕。本實(shí)驗(yàn)觀察GEN對(duì)腦缺血再灌注(I/R)損傷的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)選擇觀察小腦浦肯野神經(jīng)元缺血再灌注損傷的存活率是因其對(duì)缺血敏感，缺血性損傷和死亡在小腦腦片上容易識(shí)別。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與設(shè)備 SD大鼠(蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，Genistein(Sigma公司)，CK(南京建成生物工程研究所)，Tris-GTP、EGTA、Mg2+-ATP、HEPES(Sigma 公司)、振蕩切片機(jī)(美國(guó)VIBRATOME公司)，721分光光度計(jì)(上海湖光科學(xué)儀器公司)。

1.2 溶液配制 人工腦脊液(ACSF)Ⅰ組成(mmol/L):124 NaCl，3 KCl，1.3 NaH2PO4，26 NaHCO3，10 dextrose，5 HEPES，0.5 CaCl2和4 MgSO4，pH 7.35～7.45(1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH)。ACSFⅡ組成(mmol/L):124 NaCl，3 KCl，1.3 NaH2PO4，26 NaHCO3，10 dextrose，5 HEPES，2.4 CaCl2和 1.3 MgSO4，pH7.35～7.45(1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH)。

1.3 腦片的制備 取出生后17～21 d SD大鼠，放入4 L鐘形玻璃容器，容器內(nèi)放入2 ml異氟烷，行異氟烷吸入麻醉。刀片斷頭，取出小腦，去除腦干及小腦半球，將小腦蚓部放入充分氧合(通95%O2和5%CO2)的冰水混合的ACSFⅠ中。將小腦蚓部切成400 μm腦片，放入充分氧合(通95%O2和5%CO2)的ACSFⅡ，在25℃條件下孵育1 h以恢復(fù)細(xì)胞功能。

1.4 體外缺血再灌注模型制備〔3〕將小腦腦片轉(zhuǎn)移至40 ml無(wú)氧(通95%N2和5%CO230 min)無(wú)糖的ACSF培養(yǎng)液中培養(yǎng)20 min模擬缺血，再轉(zhuǎn)移至充分氧合的ACSFⅡ培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 h，用來(lái)模擬再灌注，使OGD造成的細(xì)胞損傷和死亡更加明顯。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 ①正常對(duì)照組:以充分氧合的ACSFⅡ培養(yǎng)腦片6 h;②缺血再灌(I/R)組:先以充分氧合的ACSFⅡ培養(yǎng)腦片100 min，再轉(zhuǎn)移至OGD液20 min，最后轉(zhuǎn)移至充分氧合的ACSFⅡ培養(yǎng)即再灌4 h;③GEN高、中、低劑量組:先以充分氧合的ACSFⅡ培養(yǎng)腦片60 min，后分別轉(zhuǎn)至含GEN 200、100和50 mol/L的ACSFⅡ培養(yǎng)腦片20 min，再轉(zhuǎn)至無(wú)GEN的ACSFⅡ培養(yǎng)腦片20 min后轉(zhuǎn)移至OGD液20 min，最后再灌4 h;④尼莫地平組:先以充分氧合的ACSFⅡ培養(yǎng)腦片100 min，再轉(zhuǎn)移至含尼莫地平10 mol/L OGD液20 min，最后轉(zhuǎn)移至充分氧合的ACSFⅡ培養(yǎng)即再灌4 h。

1.6 形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn) 再灌注后的腦片置于4%的甲醛溶液4℃保存24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，取腦片內(nèi)部組織做病理切片(距邊緣約100 μm組織)以排除在腦片制備中直接受損的區(qū)域并進(jìn)行HE染色，檢測(cè)未受損浦肯野細(xì)胞的百分比即存活率。有下列特征之一則視為受損:腫脹、空泡化或細(xì)胞固縮核深染。腦片的每個(gè)區(qū)域至少有50個(gè)浦肯野細(xì)胞被計(jì)數(shù)或3個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)的總數(shù)超過(guò)150個(gè)浦肯野細(xì)胞。

1.7 小腦組織CK活力測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 糖氧剝奪和恢復(fù)糖氧灌流誘導(dǎo)浦肯野細(xì)胞損傷 見圖1。

圖1 GEN對(duì)浦肯野細(xì)胞I/R損傷病理學(xué)的影響(HE，×400)

2.2 GEN預(yù)適應(yīng)20 min后糖氧剝奪和恢復(fù)糖氧灌流浦肯野細(xì)胞的存活率變化 與正常對(duì)照組相比，I/R組浦肯野細(xì)胞的存活率明顯降低(P＜0.0005)。與I/R組比較，GEN 200和100 mmol/L預(yù)適應(yīng)組浦肯野細(xì)胞的存活率明顯增加(P＜0.005和P＜0.01)，GEN 50 mmol/L預(yù)適應(yīng)組浦肯野細(xì)胞的存活率略有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)顯著性。見表1。

表1 GEN對(duì)浦肯野細(xì)胞存活率BCK活性的影響(n=8，±s)

表1 GEN對(duì)浦肯野細(xì)胞存活率BCK活性的影響(n=8，±s)

與I/R組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.005，3)P＜0.001;與正常對(duì)照組比較:4)P＜0.0005

組別 劑量(mmol/L)存活率(%) CK(U/mg)正常對(duì)照組85±7 21.65±3.24 I/R組 0 31±74) 8.97±1.854)GEN組 50 35±9 10.03±2.39100 45±111) 12.47±2.681)200 59±92) 16.04±3.243)尼莫地平 10 46±101) 13.03±2.821)0

2.3 GEN預(yù)適應(yīng)20 min后糖氧剝奪和恢復(fù)糖氧灌流小腦組織CK活性變化 與正常對(duì)照組相比，I/R組小腦組織CK活性明顯升高(P＜0.0005)。與 I/R組比較，GEN 200和100 mmol/L預(yù)適應(yīng)組小腦組織CK活性明顯降低(P＜0.001或P＜0.01)，GEN 50 mmol/L預(yù)適應(yīng)組小腦組織CK活性略有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)顯著性。見表1。

3 討論

IPC是通過(guò)調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)如腺苷、緩激肽、降鈣素基因相關(guān)肽、PGI2、NO 等來(lái)提高缺血的耐受性〔4，5〕。目前，預(yù)適應(yīng)的方法不再局限于腦缺血，而是涵蓋了許多“亞毒性”的侵害性物質(zhì)或措施。藥理性預(yù)適應(yīng)是根據(jù)IPC機(jī)制，通過(guò)藥物模擬或誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)而起到預(yù)適應(yīng)的作用〔6〕。

有關(guān)腦缺血再灌注損傷的模型較多，有在體的動(dòng)物模型，也有離體的模型。OGD模型是一種較好的離體腦缺血模型，OGD模型是通過(guò)移除培養(yǎng)液中的葡萄糖和氧氣模擬缺血，再恢復(fù)到正常的培養(yǎng)條件模擬再灌注。該模型所得資料類似于采用其他在體或離體缺血模型的實(shí)驗(yàn)資料，并且在實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用已得到認(rèn)可。與在體的腦缺血再灌注損傷的模型相比，OGD模型便于控制和改變細(xì)胞外環(huán)境，可選擇特定類型的細(xì)胞，并能在體外研究單個(gè)細(xì)胞的胞內(nèi)狀況，因此，這種模型在神經(jīng)保護(hù)機(jī)制方面的研究是常用的。

細(xì)胞內(nèi)鈣超載與自由基損害是腦缺血再灌注損傷的重要發(fā)病機(jī)制。腦缺血再灌注后，大量氧自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過(guò)氧化，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和完整性遭到破壞，最終使細(xì)胞膜的通透性增加，胞漿酶被釋放到細(xì)胞間隙，使腦組織中的酶活性降低。已知腦組織中廣泛存在CK，有實(shí)驗(yàn)及臨床觀察證明腦缺血時(shí)腦組織CK釋放增加。因此，檢測(cè)腦組織中CK的含量變化可準(zhǔn)確反映腦組織細(xì)胞受損的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示GEN預(yù)適應(yīng)可以減少腦缺血壞死的程度，對(duì)小腦浦肯野細(xì)胞缺血再灌注有保護(hù)作用。大量的研究表明，GEN類物質(zhì)通過(guò)提高體內(nèi)酶促抗氧化防御系統(tǒng)能力，清除氧自由基保護(hù)缺血再灌注的腦組織〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明GEN也是通過(guò)提高體內(nèi)酶促抗氧化防御系統(tǒng)能力，清除氧自由基來(lái)保護(hù)缺血再灌注的小腦浦肯野細(xì)胞。腦缺血后由于ATP生成減少，引發(fā)胞外大量的Ca2+內(nèi)流，同時(shí)激活細(xì)胞內(nèi)Ca2+庫(kù)的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+超載，激活了各種降解酶如DNA酶、鈣調(diào)磷酸酶、蛋白酶和磷脂酶，同時(shí)過(guò)量Ca2+沉積于線粒體，使線粒體氧化磷酸化失耦聯(lián)進(jìn)一步加重，膜電位喪失，呼吸鏈解體，導(dǎo)致細(xì)胞能量的嚴(yán)重丟失，同時(shí)致使O2經(jīng)單電子還原生成超氧陰離子增多，產(chǎn)生的大量自由基，引起DNA、蛋白質(zhì)和磷脂降解，細(xì)胞代謝、結(jié)構(gòu)與功能多方面的異常改變，神經(jīng)細(xì)胞逐步死亡〔8〕。本實(shí)驗(yàn)表明GE N可能通過(guò)抑制細(xì)胞鈣通道，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，進(jìn)而減輕I/R損傷。近來(lái)研究也表明，大豆異黃酮可能通過(guò)抑制電壓依賴性鈣通道從而影響心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程〔9〕。

1 龍 軍，張 良，袁冬平，等.大豆異黃酮對(duì)腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)再生的影響〔J〕.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011;27(1):49-55.

2 Lim YJ，Zheng S，Zuo Z.Morphine preconditions purkinje cells against cell death under in vitro simulated ischemia-reperfusion conditions〔J〕.Anesthesiology，2004;100(3):562-8.

3 Zhao S，Chen N，Yang Z，et al.Ischemia deteriorates the spike encoding of rat cerebellar Purkinje cells by raising intracellular Ca2+〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2008;366(2):401-7.

4 Pasupathy S，Homer-Vanniasinkam S.Ischaemic preconditioning protects against ischaemia/reperfusion injury:emerging concepts〔J〕.Eur J Vasc Endovasc Surg，2005;29(2):106-15.

5 Arrell DK，Elliott ST，Kane LA，et al.Proteomic analysis of pharmacological preconditioning:novel protein targets converge to mitochondrial metabolism pathways〔J〕.Circ Res，2006;99(7):706-14.6 熊利澤，路志紅.腦缺血預(yù)處理研究進(jìn)展〔J〕.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002;23(15):1347-8.

7 邢 巖，田慶偉，王永明，等.大豆異黃酮對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用〔J〕.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2006;28(1):85-6.

8 李智慧，田慶偉，邢 巖，等.大豆異黃酮對(duì)腦缺血再灌注模型小鼠抗氧化系統(tǒng)的影響〔J〕.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005;11(1):45-7.

9 馬麗娟，趙春燕，張文杰，等.大豆異黃酮對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞鈣電流和動(dòng)作電位的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2006;26(2):206-8.