不同熱應(yīng)激條件下添加二氫吡啶對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵功能的影響

趙新茂，隋 晨，王肆玖，金爾光，才 航，易建明＊

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，湖北 武漢 430065）

二氫吡啶（Dihydropyridine）的化學(xué)名稱為2，6－二甲基－3，5－二乙酯基－l，4－二氫吡啶，其主要結(jié)構(gòu)是l，4－二氫吡啶環(huán)和NH基。二氫吡啶是農(nóng)業(yè)部首次批準(zhǔn)在我國(guó)使用的獸藥類促生長(zhǎng)添加劑，現(xiàn)已列入農(nóng)業(yè)部《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003年版中。大量研究表明，二氫吡啶能夠抗氧化、保護(hù)生物膜，提高血清甲狀腺素水平，提高促卵泡激素（FSH）和促黃體激素（LH）的含量，降低血清中皮質(zhì)醇的含量，提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)礦物質(zhì)的消化吸收等［1－6］。因此，二氫吡啶作為一種非營(yíng)養(yǎng)性添加劑受到廣泛關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于二氫吡啶在奶牛上的研究主要有其對(duì)產(chǎn)奶量，乳中成分，產(chǎn)奶量及抗氧化的影響等，李成會(huì)等［7］在奶牛精料補(bǔ)充料中添加150mg／kg二氫吡啶，試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)奶量提高6.19%。陳桂榮等［8］在奶牛精料補(bǔ)充料中添加100mg／kg二氫吡啶，結(jié)果試驗(yàn)組奶牛日平均產(chǎn)奶量提高了8.6%（P＜0.01），平均乳脂率提高了21.9%（P ＜0.05），而且添加二氫吡啶后，奶牛健康狀況有了很大的改善。朱蓮英等［9］在奶牛日糧中添加150mg／kg二氫吡啶，產(chǎn)奶量也提高了5.65%，隱性乳房炎的發(fā)病率降低了71.4%。曹杰［10］（2010）在商品濃縮料和自配精飼料中添加0.02%二氫吡啶，提高了血漿中SOD、GSH－Px、CAT酶活力，減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)量。而二氫吡啶對(duì)熱應(yīng)激奶牛瘤胃發(fā)酵狀態(tài)影響的研究報(bào)道極少。因此，本試驗(yàn)擬通過(guò)研究飼糧中添加二氫吡啶對(duì)熱應(yīng)激奶牛瘤胃發(fā)酵功能的影響，為二氫吡啶在對(duì)抗奶牛熱應(yīng)激領(lǐng)域的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

二氫吡啶（DHP，純度≥98%），購(gòu)自武漢市合中生化制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)動(dòng)物根據(jù)胎次（3.0±0.05）、產(chǎn)奶量（20.52±0.33kg）、體重相近（504.0±6.0kg）的原則，選取6頭泌乳中期（104.8±12.0d）健康的中國(guó)荷斯坦奶牛。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)有兩因素，因素一為氧化應(yīng)激狀態(tài)（Stress）：春季無(wú)應(yīng)激和夏季應(yīng)激；因素二為二氫吡啶添加量（二氫吡啶添加劑量參照農(nóng)業(yè)部《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003年版），分別為0.0g／（頭·d）和3.0g／（頭·d）。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 試驗(yàn)飼糧及飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)在湖北省武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所金口基地奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。奶牛飼養(yǎng)方式采用雙列對(duì)頭固定頸夾式飼養(yǎng)，舍內(nèi)配備臥床，奶牛自由采食、自由運(yùn)動(dòng)。各處理組之間除有無(wú)添加二氫吡啶不同外，奶牛飼養(yǎng)管理一致。喂料方式為先粗后精，人工飼喂。每日飼喂3次，分別于07：00、13：00和19：00飼喂，每次喂料結(jié)束后散放到運(yùn)動(dòng)場(chǎng)自由運(yùn)動(dòng)，飲水槽保證足夠清潔的飲水。每天擠奶2次，每次均記錄產(chǎn)奶量，每月一次DHI測(cè)定。使用時(shí)將二氫吡啶先與少量精料混勻，再逐級(jí)擴(kuò)大直至與所有飼料混勻，因二氫吡啶本身極易氧化，所以在試驗(yàn)過(guò)程中采取隨制隨喂的方法，以期獲得最理想的效果。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分表1

1.4 樣品采集

試驗(yàn)分春季和夏季兩個(gè)階段，每個(gè)階段兩個(gè)時(shí)期，全部動(dòng)物試驗(yàn)共計(jì)4個(gè)時(shí)期（NS－ND，無(wú)應(yīng)激不添加二氫吡啶；NS－D，無(wú)應(yīng)激添加二氫吡啶；S－ND，應(yīng)激不添加二氫吡啶；S－D，應(yīng)激添加二氫吡啶），每個(gè)時(shí)期15d。試驗(yàn)周期安排見(jiàn)圖1。

圖1 試驗(yàn)周期

每期飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，于第14d的13：00和第15d的7：00、10：00采集瘤胃液樣品（瘤胃穿刺法）30mL左右，即飼喂后的6h和飼喂前0h、3h采集共3次，－20.0℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

pH采用Sartotius普及型pH計(jì)測(cè)定（PB－10）；NH3－N濃度的測(cè)定參照馮宗慈等［11］比色法；VFA濃度的測(cè)定按照曹慶云等［12］氣相色譜法。通過(guò)監(jiān)測(cè)環(huán)境溫濕度變化來(lái)評(píng)價(jià)奶牛的熱應(yīng)激狀況。將干濕球溫度表懸掛于奶牛走道和臥床上方，距地面2 m，室內(nèi)和室外各3個(gè)，試驗(yàn)期間每天在8：00、14：00和20：00記錄溫濕度表讀數(shù)，并換算為T(mén)HI即溫濕指數(shù)。THI計(jì)算公式為：THI＝0.72（Td＋Tw）＋40.6，其中Td為干球溫度，Tw為濕球溫度。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件整理，SAS 8.1軟件處理，用雙因素方差分析中的GLM過(guò)程。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)期間牛舍環(huán)境狀況及THI的變化

試驗(yàn)期間牛舍溫濕環(huán)境狀況及THI變化結(jié)果見(jiàn)表3、圖2a／b。

表3 試驗(yàn)期間牛舍溫?zé)岘h(huán)境狀況

由表3可知，春季牛舍最高溫度24.0℃，最低溫度6.5℃；濕度范圍5.5～18.5（即51%～95%的濕度）；THI的范圍為49.24～69.76。而夏季牛舍最高溫度37.0℃，最低溫度25.5℃；濕度范圍為25.0～34.0（30%～95%的濕度）；THI指數(shù)的范圍為76.96～90.28。

圖2a 春季室內(nèi)THI指數(shù)變化

圖2b 夏季室內(nèi)THI指數(shù)變化圖2a／b 試驗(yàn)期間牛舍溫濕指數(shù)變化

由圖2a／b可知，春季每天3個(gè)測(cè)定時(shí)間的THI都低于69.80，而夏季每天3個(gè)測(cè)定時(shí)間的THI值都高于76.96。另外，從圖中可以看到，春季早中晚的溫差較小，而夏季較大；并且在一天之中，THI的基本變化趨勢(shì)為中午＞晚上＞早上。

2.2 不同應(yīng)激水平下添加二氫吡啶對(duì)奶牛瘤胃液發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃發(fā)酵參數(shù)可以反應(yīng)瘤胃的發(fā)酵模式和飼料在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵程度。不同應(yīng)激水平下添加二氫吡啶對(duì)奶牛瘤胃液發(fā)酵參數(shù)的影響見(jiàn)表4。

2.2.1 不同應(yīng)激水平下添加二氫吡啶對(duì)奶牛瘤胃pH的影響 各時(shí)期試驗(yàn)?zāi)膛５牧鑫敢簆H值均在6.00～7.20之間，均處于正常范圍內(nèi)，可以保證瘤胃微生物的正常代謝。S－ND時(shí)期與NS－ND時(shí)期相比，瘤胃液的pH值顯著下降（P＜0.01）。添加二氫吡啶，可降低瘤胃液的pH值，在夏季添加二氫吡啶未達(dá)到顯著水平。熱應(yīng)激和二氫吡啶對(duì)pH值的影響不存在互作。

表4 不同應(yīng)激水平下添加二氫吡啶對(duì)奶牛瘤胃液發(fā)酵參數(shù)1的影響

2.2.2 不同應(yīng)激水平下添加二氫吡啶對(duì)奶牛瘤胃液NH3－N濃度的影響 從表4可知春季和夏季添加二氫吡啶后，NH3－N濃度均極顯著降低（P＜0.01），下降幅度分別為29.8%和29.4%。S－ND時(shí)期與NS－ND時(shí)期相比，瘤胃液中NH3－N濃度呈升高的趨勢(shì)，且差異顯著（P＜0.01）。即應(yīng)激提高了瘤胃液中NH3－N的濃度，而二氫吡啶降低了NH3－N 的濃度。

2.2.3 不同應(yīng)激水平下添加二氫吡啶對(duì)奶牛瘤胃液VFA的影響 從表4可知，S－ND時(shí)期與NS－ND時(shí)期相比，瘤胃液VFA的濃度極顯著下降（P＜0.01），下降幅度為25.0%。添加二氫吡啶可以顯著提高VFA的濃度，在春季和夏季均達(dá)到極顯著水平（P ＜0.01），分別提高了31.0%和12.2%。隨應(yīng)激水平的升高，乙酸、丙酸和丁酸三者的百分含量呈現(xiàn)出不一致的變化趨勢(shì)，其中乙酸的百分比含量下降，而丙酸和丁酸的百分比含量升高。添加二氫吡啶后，乙酸百分含量有所升高，春季和夏季均達(dá)到顯著水平，升高幅度分別為3.37%和2.13%。丙酸和丁酸的百分含量則呈相反的變化趨勢(shì)，丙酸的百分含量在春季和夏季添加二氫吡啶后，均下降且差異極顯著（P＜0.01），丁酸的百分含量在春季添加二氫吡啶后下降，夏季時(shí)有上升的趨勢(shì)，但差異不顯著。S－ND時(shí)期與NS－ND時(shí)期相比，乙丙比呈下降趨勢(shì)，但差異不顯著（P＝0.13），在春季和夏季添加二氫吡啶后均極顯著增高（P＜0.01）。說(shuō)明添加二氫吡啶可以改變瘤胃的發(fā)酵模式。熱應(yīng)激和二氫吡啶對(duì)瘤胃液發(fā)酵參數(shù)的影響不存在互作效應(yīng)。

3 討論

3.1 牛舍環(huán)境溫濕度的變化

溫?zé)岘h(huán)境是指家畜周?chē)諝庵械臏嘏⒀谉崤c寒冷，它由空氣的溫度、濕度、氣流速度和太陽(yáng)熱輻射等溫?zé)嵋蛩鼐C合而成。環(huán)境溫濕度的變化常常導(dǎo)致奶牛處于應(yīng)激狀態(tài)，用來(lái)衡量奶牛是否處于熱應(yīng)激狀態(tài)的常用且實(shí)際操作方便可行的辦法就是測(cè)定環(huán)境指標(biāo)。常用的環(huán)境指標(biāo)主要有環(huán)境溫度、溫濕指數(shù)、體感溫度等。溫濕指數(shù)是結(jié)合了溫度和濕度兩個(gè)因素來(lái)綜合評(píng)價(jià)環(huán)境狀況的指標(biāo)，是用于評(píng)定奶牛是否處于熱應(yīng)激的一個(gè)重要參數(shù)。

根據(jù)美國(guó)堪薩斯州立大學(xué)和美國(guó)新澤西州立大學(xué)的研究結(jié)果表明，當(dāng)溫濕指數(shù)THI≥72時(shí)，奶牛即處于熱應(yīng)激狀態(tài)。當(dāng)THI≥78時(shí)，奶牛處于嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激狀態(tài)。目前該評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)已得到各國(guó)研究人員的廣泛認(rèn)可（Michael B，2005）［13］。由上述結(jié)果和分析可知，本試驗(yàn)在春季（THI＝49.24－69.76）奶牛無(wú)熱應(yīng)激，在夏季（THI＝76.96－90.28）牛舍內(nèi)溫濕環(huán)境對(duì)試驗(yàn)?zāi)膛?gòu)成熱應(yīng)激。即在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)外界溫?zé)岘h(huán)境對(duì)奶牛構(gòu)成的應(yīng)激狀況完全符合試驗(yàn)的要求。

3.2 奶牛瘤胃液pH值和NH3－N的變化

瘤胃始終維持著相對(duì)穩(wěn)定的厭氧環(huán)境，瘤胃內(nèi)pH值的穩(wěn)定是保證瘤胃正常發(fā)酵的基礎(chǔ)。影響瘤胃內(nèi)pH值的因素主要有反芻動(dòng)物唾液中的緩沖鹽含量、瘤胃內(nèi)VFA的濃度、瘤胃對(duì)VFA的吸收速度等。過(guò)高和過(guò)低的瘤胃pH值不利于保證瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，對(duì)瘤胃微生物正常生長(zhǎng)和繁殖也是不利的。隨著應(yīng)激水平的升高，奶牛的瘤胃液pH值呈 下 降 趨 勢(shì)，這 與 Bhatta（2006）［14］、Kristensen（2004）［15］的報(bào)道一致。因?yàn)槔w維在體內(nèi)的消化和代謝會(huì)產(chǎn)生更多的熱量，所以奶牛會(huì)本能的減少對(duì)粗料的采食，這會(huì)導(dǎo)致奶牛實(shí)際采食的日糧中精粗比例發(fā)生變化，精料比例相對(duì)升高，所以導(dǎo)致的結(jié)果就是乙酸產(chǎn)量下降，pH值降低。本試驗(yàn)中瘤胃液的pH值在6.00～7.20之間，均處于正常范圍內(nèi)，可以保證瘤胃微生物的正常生長(zhǎng)代謝。瘤胃內(nèi)微生物氮源的主要來(lái)源是NH3－N，瘤胃內(nèi)NH3－N的濃度直接反映了微生物氮的供應(yīng)情況。瘤胃中約三分之一的細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中必需NH3－N，約有一半以上的細(xì)菌以NH3－N為唯一氮源。若瘤胃內(nèi)NH3－N濃度過(guò)低，則瘤胃微生物的生長(zhǎng)受到抑制，瘤胃內(nèi)微生物蛋白的合成也會(huì)受阻；若瘤胃內(nèi)NH3－N濃度過(guò)高，則會(huì)降解為大量的氨，經(jīng)瘤胃壁吸收最終進(jìn)入肝臟代謝，造成氮源的浪費(fèi)又使多余的NH3－N進(jìn)入肝臟降解，加重了機(jī)體代謝氮的負(fù)擔(dān)。本試驗(yàn)中各時(shí)期奶牛的NH3－N濃度均呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律：在進(jìn)食逐漸上升，然后下降至進(jìn)食前的水平。各時(shí)期試驗(yàn)牛的瘤胃 NH3－N 在11.08～24.80mg／100mL之間，均在5.0～28.0mg／100mL的正常范圍內(nèi)，能夠保證瘤胃微生物蛋白的正常合成。本試驗(yàn)中，添加二氫吡啶后，奶牛瘤胃內(nèi)的NH3－N濃度呈下降趨勢(shì)，但處于正常的濃度范圍內(nèi)，推測(cè)二氫吡啶可促進(jìn)瘤胃微生物蛋白質(zhì)的合成，且能夠改善較高濃度的NH3－N對(duì)奶牛機(jī)體的不利影響，提高飼料的利用率。

3.3 奶牛瘤胃液VFA的變化

在反芻動(dòng)物體內(nèi)最為重要的VFA是乙酸、丙酸和丁酸，正常情況下瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的這三種酸占到95%以上，而這些VFA又以乙酸為主，占VFA的70%左右，這三種酸都是反芻動(dòng)物重要的能量來(lái)源。粗纖維發(fā)酵降解最終生成乙酸，乙酸和丁酸主要用于合成脂肪，丙酸則主要由精飼料發(fā)酵降解生成，主要用于合成葡萄糖。本試驗(yàn)中熱應(yīng)激顯著降低了瘤胃液中 VFA的濃度，這與Bandaranayaka（1976）［16］的研究結(jié)果一致，推測(cè)VFA濃度的降低應(yīng)歸因于DMI的下降（Kiyoshi Tajima，2007）［17］，奶牛的采食量下降，瘤胃內(nèi)可利用的能量減少，影響了瘤胃內(nèi)微生物的數(shù)量和活性。同時(shí)乙酸的百分含量下降，這與Bernabucci（1999）［18］的研究結(jié)果一致。瘤胃內(nèi)AC／PC的比值呈下降的趨勢(shì)。即熱應(yīng)激改變了瘤胃的發(fā)酵模式。添加二氫吡啶后VFA的濃度有顯著的增高趨勢(shì)，同時(shí)也顯著提高了乙酸丙酸比，降低了丙酸和丁酸的比例。

4 結(jié)論

熱應(yīng)激導(dǎo)致奶牛瘤胃液pH值下降，NH3－N濃度升高，VFA的濃度降低，同時(shí)乙酸的百分含量下降，丙酸和丁酸的百分含量小幅上升。添加二氫吡啶有降低瘤胃pH值的趨勢(shì)，但均在瘤胃微生物活動(dòng)的適宜范圍內(nèi)；降低NH3－N的濃度，促進(jìn)了瘤胃對(duì)NH3－N的利用；提高VFA的產(chǎn)量和乙酸丙酸比。

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