不同劑量骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠矽肺纖維化形成的影響*

趙曼曼， 崔建忠， 李 冉， 都凌杰， 田艷霞， 闞 泉， 張 娟， 高俊玲△

(1河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組胚教研室，河北省煤礦衛(wèi)生與安全實(shí)驗(yàn)室，2唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山 063000)

矽(塵)肺病是我國(guó)最為嚴(yán)重的職業(yè)衛(wèi)生問題之一，在職業(yè)病中發(fā)病率和死亡率均較高，嚴(yán)重危害我國(guó)的生產(chǎn)力和勞動(dòng)人民的身體健康，成為影響社會(huì)健康持續(xù)發(fā)展的重大公共衛(wèi)生和社會(huì)問題。直至目前，矽肺纖維化的發(fā)病機(jī)理尚未明確，無早期診斷的特異性指標(biāo)，無特異性治療藥物和方法，不可治愈，無法逆轉(zhuǎn)。因此，尋找一種安全、有效、低毒的新型抗矽肺纖維化藥物或措施已經(jīng)成為迫切需要解決的問題。近年來，隨著干細(xì)胞研究的深入發(fā)展，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)為代表的干細(xì)胞移植治療在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的肺損傷、博來霉素和石棉引起的肺纖維化中有積極的效果[1]。然而，BMSCs在矽肺纖維化中是否同樣發(fā)揮作用，至今鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用SiO2氣管內(nèi)灌注法制作大鼠矽肺纖維化模型，并給予不同劑量BMSCs治療，通過觀察組織形態(tài)學(xué)改變、檢測(cè)炎癥因子及膠原蛋白表達(dá)情況，探討B(tài)MSCs外源性移植對(duì)大鼠矽肺纖維化的療效及其量效關(guān)系，為矽肺纖維化的防治研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 BMSCs的供體動(dòng)物:選擇SPF級(jí)幼年雄性SD大鼠10只，3～6周齡，體重100～120 g;BMSCs的受體動(dòng)物:選擇SPF級(jí)成年雌性SD大鼠50只，體重180～220 g，均由北京維通利華動(dòng)物公司提供。

1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco;10%胎牛血清購自HyClone;0.25%胰酶購自Sigma;SiO2粉塵購自Sigma;Masson三色染色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物有限公司;DAB顯色試劑盒購自北京天根生物技術(shù)有限公司;BCIP/NBT顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司;RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑購自上海貝博生物技術(shù)有限公司;PVDF膜購自Roche，Ⅰ抗羊抗鼠的多克隆抗體性別決定區(qū)Y(sex－determining region Y，SRY)蛋白及兔抗鼠的多克隆抗體腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factor β，TGF －β)、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和β －actin均購自Santa Cruz;Ⅱ抗山羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司;Alexa Fluor標(biāo)記的熒光Ⅱ抗驢抗羊IgG購自Santa Cruz。

2 方法

2.1 大鼠BMSCs的分離及培養(yǎng) 頸椎脫臼處死大鼠，無菌分離股骨和脛骨，暴露骨髓腔。用DMEM高糖培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集沖洗液，1000 r/min低溫離心10 min后棄去上清液，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。計(jì)數(shù)后按1×105/cm2密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h后首次換液，以后每2～3 d換液1次。待細(xì)胞95%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化，按1∶2的比例進(jìn)行傳代，細(xì)胞傳至第3代用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型制備 將50只雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組:(1)對(duì)照組:每只大鼠左、右支氣管內(nèi)各灌注滅菌氯化鈉溶液0.5 mL;(2)矽肺模型組:每只大鼠左、右支氣管內(nèi)各灌注滅菌氯化鈉溶液與SiO2粉塵混懸液(50 g/L)0.5 mL;(3)BMSCs治療A組:每只大鼠于造模成功后24 h經(jīng)尾靜脈注射BMSCs與DMEM懸液1.0 mL(1×109/L);(4)BMSCs治療B組:每只大鼠于造模成功后24 h經(jīng)尾靜脈注射BMSCs與DMEM懸液1.0 mL(3×109/L);(5)BMSCs治療C組:每只大鼠于造模成功后24 h經(jīng)尾靜脈注射BMSCs與DMEM懸液1.0 mL(5×109/L)。于造模后21 d處死各組大鼠取材備用。

2.3 肺組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 取右肺下部肺組織以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛常規(guī)固定24 h、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋、5 μm連續(xù)切片。進(jìn)行HE染色及Masson染色(按Masson三色染色試劑盒說明書進(jìn)行操作)，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TNF－α和TGF－β 操作按SABC免疫組化試劑盒說明進(jìn)行，烤片，脫蠟，滅活，抗原修復(fù)，BSA封閉，兔抗鼠的多克隆抗體4℃孵育過夜(均為 1∶50)，陰性對(duì)照用 PBS(0.01 mol/L，pH 7.3)代替Ⅰ抗孵育，山羊抗兔IgG室溫孵育30 min，SABC室溫20 min，DAB顯色。蘇木素輕度復(fù)染，中性樹膠封片。將切片用Image Pro－Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以積分吸光度(integrated absorbance value，IA)值表示，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)(400倍)具有代表性的相互非重疊高倍視野進(jìn)行測(cè)定。

2.5 免疫印跡法檢測(cè) TNF－α、TGF－β、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的蛋白表達(dá)量 取肺組織100 mg，加入1 mL RIPA裂解液，4 μL蛋白酶抑制劑，低溫下勻漿，10000 r/min低溫離心10 min。標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線測(cè)定上清蛋白濃度，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5% 脫脂奶粉37℃封閉2 h，兔抗鼠多克隆抗體(TNF－α、TGF－β和 β－actin工作濃度:1∶500)4℃孵育過夜，山羊抗兔IgG(工作濃度:1∶3000)37℃孵育2 h。以BCIP/NBT避光顯色。將PVDF膜用掃描儀掃描后，經(jīng)ImageJ圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，以目標(biāo)與內(nèi)參照(β－actin)吸光度(A)值的比值作為分析對(duì)象進(jìn)行比較。

2.6 免疫熒光染色法檢測(cè)SRY表達(dá)情況 留取心、肝、脾、腎、肺組織標(biāo)本，經(jīng) 4%甲醛固定 24 h，入30%蔗糖溶液(0.1 mol/L PBS，pH 7.4)，浸泡至組織塊沉底，OCT包埋劑包埋，恒溫箱冰凍切片機(jī)切片(片厚15 μm)。滴加0.4%Triton －100 孵育10 min，驢血清封閉1 h，滴加SRY抗體(工作濃度:1∶200)，4℃濕盒孵育過夜，陰性對(duì)照用PBS(0.01 mol/L，pH 7.3)代替Ⅰ抗孵育，加入Alexa Fluor標(biāo)記的熒光Ⅱ抗(工作濃度:1∶1000)，37℃濕盒避光孵育2 h，中性甘油封片，用激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000)觀察并攝片。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察

原代細(xì)胞在48 h之內(nèi)貼壁，以分散的克隆聚集方式增殖，細(xì)胞形態(tài)基本為均勻紡錘形和梭形，核居中，偶有寬大扁平的多邊形細(xì)胞。造血干細(xì)胞及其它細(xì)胞呈非貼壁生長(zhǎng)，通過多次換液逐漸減少，BMSCs純化。2周后原代細(xì)胞95%融合，進(jìn)行傳代。傳代后細(xì)胞度過生長(zhǎng)抑制期，增長(zhǎng)加速，呈現(xiàn)漩渦狀和放射狀集落生長(zhǎng)傾向，隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞形態(tài)更為均一，為梭形成纖維細(xì)胞樣。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為第3代BMSCs。依據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、形態(tài)特征和前期實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，鑒定其為BMSCs。

2 HE染色形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組見肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，未見明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)。矽肺模型組見肺泡間隔增寬，肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主，有明顯矽結(jié)節(jié)形成。BMSCs治療A組肺泡間隔略增寬，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，矽結(jié)節(jié)少且小。BMSCs治療B組較A組的病理改變更輕。BMSCs治療C組較矽肺模型組病變程度加重，肺泡結(jié)構(gòu)破壞消失，矽結(jié)節(jié)多且大，并且出現(xiàn)部分融合現(xiàn)象，見圖1。

Figure1.The morphological observation of lung tissue in each group(HE staining，×200).A:control group;B:model group;C:BMSCs A group;D:BMSCs B group;E:BMSCs C group.圖1 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察

3 Masson染色形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果

Masson染色可見膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維、胞質(zhì)、紅細(xì)胞呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)褐色。對(duì)照組大鼠肺間質(zhì)內(nèi)有少量纖細(xì)的膠原分布。矽肺模型組肺組織見大片狀密集的膠原纖維沉積，小血管壁及支氣管周圍膠原增生明顯，并向肺間質(zhì)延伸，呈網(wǎng)狀或束狀。BMSCs治療A組大鼠肺組織膠原沉積明顯減少，呈小片狀或小束狀，BMSCs治療B組較A組改善情況更顯著。BMSCs治療C組較矽肺模型組肺組織膠原沉積更加致密，且結(jié)節(jié)內(nèi)數(shù)量不等的膠原纖維呈同心圓排列，纖維化程度加重，見圖2。

Figure2.The collagen changes of lung tissue in each group(Masson staining，×400).A:control group;B:model group;C:BMSCs A group;D:BMSCs B group;E:BMSCs C group.圖2 各組大鼠肺組織的膠原變化

4 TNF－α和TGF－β的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

TNF－α和TGF－β陽性表達(dá)產(chǎn)物為棕褐色，呈顆粒狀分布于胞漿中，顏色越深表達(dá)越強(qiáng)，細(xì)胞核復(fù)染呈藍(lán)色。對(duì)照組TNF－α和TGF－β陽性細(xì)胞偶見于肺泡間質(zhì)。矽肺模型組見大量棕黃色陽性細(xì)胞，多數(shù)聚集在矽結(jié)節(jié)內(nèi)，并主要定位于炎癥細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的胞漿。BMSCs治療A組較矽肺模型組陽性細(xì)胞表達(dá)有下降趨勢(shì)，數(shù)量減少，強(qiáng)度減弱(P＜0.05)。BMSCs治療B組較A組陽性細(xì)胞數(shù)量和強(qiáng)度減少減弱更加明顯(P＜0.05)。BMSCs治療C組較矽肺模型組陽性細(xì)胞數(shù)量略增多，表達(dá)強(qiáng)度略增強(qiáng)(P ＞0.05)，見圖3、4和表1。

Figure3.The expression of TNF－α protein of lung tissue in each group(immunohistochemical staining，×400).A:control group;B:model group;C:BMSCs A group;D:BMSCs B group;E:BMSCs C group.圖3 各組大鼠肺組織TNF－α蛋白表達(dá)

Figure4.The expression of TGF－β protein of lung tissue in each group(immunohistochemical staining，×400).A:control group;B:model group;C:BMSCs A group;D:BMSCs B group;E:BMSCs C group.圖4 各組大鼠肺組織TGF－β蛋白表達(dá)

表1 各組大鼠肺組織TNF－α和TGF－β蛋白的表達(dá)Table1.The expression of TNF－α and TGF－β proteins of lung tissue in each group(IA..n=10)

表1 各組大鼠肺組織TNF－α和TGF－β蛋白的表達(dá)Table1.The expression of TNF－α and TGF－β proteins of lung tissue in each group(IA..n=10)

*P ＜0.05 vs control group;▲P ＜0.05 vs model group;★P ＜0.05 vs BMSCs A group.

Protein Control Model BMSCs A BMSCs B BMSCs C TNF － α 14.83 ±1.68 45.87 ±3.18* 30.84 ±2.36▲＊ 20.84 ±2.23▲★＊ 49.05 ±3.36*TGF － β 14.31 ±1.42 41.93 ±2.89* 27.05 ±2.16▲＊ 19.52 ±2.06▲★＊ 43.85 ±3.24*

5 免疫印跡法檢測(cè)TNF－α、TGF－β、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原結(jié)果

對(duì)照組TNF－α、TGF－β、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原僅有少量基礎(chǔ)表達(dá)。矽肺模型組較模型對(duì)照組其蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。BMSCs治療A組較矽肺模型組蛋白表達(dá)明顯減弱(P＜0.05)，BMSCs治療B組較A組蛋白表達(dá)減弱更加顯著 (P＜0.05)，但仍高于對(duì)照組表達(dá)量，BMSCs治療C組較矽肺模型組蛋白表達(dá)略增強(qiáng)(P＞0.05)，見圖5。

Figure5.The expression of TNF－α，TGF－β，collagenⅠand collagenⅢproteins in lung tissues..n=10.*P＜0.05 vs control group;▲P ＜0.05 vs model group;★P＜0.05 vs BMSCs A group.1:control group;2:model group;3:BMSCs A group;4:BMSCs B group;5:BMSCs C group.圖5 各組大鼠 TNF－α、TGF－β、collagenⅠ和 collagenⅢ蛋白的表達(dá)

6 SRY的免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果

SRY陽性表達(dá)產(chǎn)物為綠色熒光，分布于胞核中。BMSCs治療B組的心、肝、脾、腎、肺組織熒光染色切片在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀測(cè)結(jié)果示:心、脾組織中未見綠色熒光，肝、腎組織中見微量綠色熒光(BMSCs在血流豐富器官瘀滯所致)，肺組織中見大量綠色熒光呈散點(diǎn)狀分布，見圖6。

討 論

Figure6.The expression of SRY of different organs in BMSCs B group(immunofluorescence，×400).A:heart;B:liver;C:spleen;D:kidney;E:lung.圖6 BMSCs治療B組大鼠心、肝、脾、腎、肺組織中SRY表達(dá)

矽肺纖維化的損傷機(jī)制復(fù)雜，且損傷后的逆轉(zhuǎn)需要多角度、多環(huán)節(jié)、多靶標(biāo)的干預(yù)策略，至今臨床上尚無明確有效的治療方法。目前鑒于對(duì)矽肺發(fā)生后組織異常修復(fù)的認(rèn)識(shí)，使得BMSCs在肺損傷中的角色逐漸引起生命科學(xué)界的關(guān)注。BMSCs是來源于骨髓的一種多能干細(xì)胞，具有高度自我更新和多方向分化的潛能(可分化為脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等多種組織細(xì)胞類型);還可感知損傷信號(hào)，遷移至損傷區(qū)，發(fā)揮修復(fù)和再生的能力[2];并且具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，進(jìn)行異體移植時(shí)可避免免疫排斥反應(yīng)[3];除此之外，BMSCs具有旁分泌功能，可生成多種細(xì)胞因子，促進(jìn)血管再生及損傷修復(fù)[4]。因此，BMSCs已經(jīng)成為具有廣泛應(yīng)用前景的各種疾病的細(xì)胞與基因治療來源。近幾年來，較多研究者不僅在動(dòng)物損傷模型(腦損傷、心肌損傷、脊髓損傷、骨損傷等)中證實(shí)明BMSCs的療效，還在諸多器官纖維化疾病中發(fā)現(xiàn)BMSCs能夠減輕膠原沉積，防治靶器官纖維化，在臨床上具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。正如Zheng等[5]證實(shí)BMSCs可抑制二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的形成，并發(fā)現(xiàn)BMSCs在一定的微環(huán)境誘導(dǎo)下可分化為肝細(xì)胞，修復(fù)肝損傷，恢復(fù)肝功能，降低肝纖維化。同年Lan等[6]證實(shí)移植BMSCs可下調(diào)肝纖維化大鼠炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肝再生，抑制活化肝星狀細(xì)胞，改善肝臟病理組織學(xué)和肝功能。此外，BMSCs還被廣泛用于治療急慢性心肌梗死，拮抗心肌纖維化。BMSCs可以轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞參與心肌收縮、改善梗死區(qū)血運(yùn)、抑制心室重構(gòu)，最終促進(jìn)心肌梗死后心功能的恢復(fù)[7]，并可通過旁分泌機(jī)制，減少心梗面積，增強(qiáng)心肌梗死的修復(fù)[8]。

總之，BMSCs為器官纖維化的防治提供了一條嶄新的思路，同時(shí)也給肺纖維化的防治帶來了希望。然而，BMSCs在肺領(lǐng)域的應(yīng)用研究落后于其它器官，主要由于肺組織細(xì)胞來自多胚層、結(jié)構(gòu)功能復(fù)雜，所以目前尚處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。有研究者將BMSCs注入博來霉素所致的肺纖維化動(dòng)物模型后，發(fā)現(xiàn)其可向肺部移行，具有明顯趨化移居傾向，并且可分化為肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等，參與損傷肺組織的修復(fù)重建[9]。盡管BMSCs在矽肺纖維化中的應(yīng)用至今鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，但如上所述為我們的設(shè)想提供了現(xiàn)實(shí)可行的依據(jù)。

本次實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)展開，為了更好的示蹤BMSCs在體內(nèi)聚集、存活及分布狀況，提取雄性幼鼠的BMSCs注入雌性成年大鼠體內(nèi)，通過監(jiān)測(cè)SRY的表達(dá)示蹤BMSCs情況。有關(guān)移植時(shí)間窗的選擇，我們參照 Ortiz等[10]及 Cui等[11]的研究結(jié)果，損傷后早期進(jìn)行BMSCs輸注有顯著的治療效果，這與肺內(nèi)損傷部位微環(huán)境隨病程發(fā)展變化有關(guān)，因此在矽肺模型制備成功后24 h經(jīng)尾靜脈注射BMSCs進(jìn)行治療。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示:BMSCs移植治療后，肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少、矽結(jié)節(jié)的數(shù)量及大小減少減小、膠原沉積及纖維化程度減輕。提示BMSCs可減緩矽肺纖維化的病理進(jìn)程，推測(cè)可能通過BMSCs向II型肺泡上皮細(xì)胞分化，在一定程度上恢復(fù)和重建肺泡上皮細(xì)胞池，使之不至于被耗盡，增加肺泡上皮細(xì)胞的來源，不斷替代已破壞的細(xì)胞，促進(jìn)組織修復(fù)，維持肺組織結(jié)構(gòu)和功能的完整性。TNF－α和TGF－β是肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages，AM)吞噬粉塵后釋放的主要致炎致纖維化因子，在矽肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原可代表晚期膠原的沉積情況，反映纖維化程度。這些可作為觀測(cè)BMSCs治療矽肺纖維化療效的指標(biāo)。免疫組織化學(xué)及免疫印跡結(jié)果顯示:BMSCs可下調(diào)TNF－α、TGF－β、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達(dá)，其可能機(jī)制是BMSCs旁分泌白細(xì)胞介素－1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist，IL1RN)[12]、TNF－α拮抗劑[10]等細(xì)胞因子，來減少炎癥因子的產(chǎn)生及阻斷導(dǎo)致纖維化的信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎/抗纖維化的作用。那么此療效與移植細(xì)胞的數(shù)量是否有關(guān)聯(lián)，我們將進(jìn)一步探討。實(shí)驗(yàn)中在BMSCs治療組設(shè)3個(gè)劑量梯度，結(jié)果顯示中劑量組較低劑量組的治療效果顯著，高劑量組不但沒有起到治療作用反而加重病情，其具體機(jī)制未明，可能由于過量的BMSCs在體內(nèi)微環(huán)境的調(diào)控下分化為肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[13]，加重矽肺纖維化程度。由此推斷BMSCs治療矽肺纖維化需要合適的細(xì)胞數(shù)量，療效與劑量之間并非正比直線關(guān)系。其具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究證實(shí)了BMSCs對(duì)矽肺纖維化有積極的治療效果，可緩解并部分逆轉(zhuǎn)肺纖維化的病理狀態(tài)、減輕炎癥反應(yīng)、抑制晚期膠原沉積、拮抗纖維化的發(fā)生，促進(jìn)肺組織損傷后的修復(fù)重建，且此療效與移植細(xì)胞數(shù)量相關(guān)。為BMSCs面向臨床的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)預(yù)防、治療乃至最終消除矽肺具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。

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