4T42肽腺病毒載體的構(gòu)建包裝及抗SKBR3乳腺癌細胞的效果

祁冬冬 陳英利 郭建壯 朱貴明 張 濤 姜 爽 王宇卓

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化與分子生物教研室，黑龍江 佳木斯 154000)

與傳統(tǒng)的腫瘤治療方法相比，抑制新生血管生成療法作用于遺傳穩(wěn)定不易變異的血管內(nèi)皮細胞，不易產(chǎn)生耐藥性;而且內(nèi)源性血管生成抑制因子具有抑制瘤床內(nèi)皮細胞增殖的高度選擇性〔1〕，因而成為腫瘤治療的一個新策略。腫瘤抑素(Tumstatin)是近年發(fā)現(xiàn)的一種活性最強的內(nèi)源性腫瘤血管生成抑制因子，可抑制血管內(nèi)皮細胞蛋白的合成，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡，進而抑制血管生成;同時還可以抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡，從而抑制腫瘤生長，但不影響生理性血管的生成〔2〕。腫瘤抑素相關(guān)活性肽T42肽具有顯著的抗腫瘤細胞活性，可明顯抑制人肝癌細胞HepG2的生長增殖，并促進其凋亡〔3〕。本實驗通過人工合成T42肽基因，構(gòu)建pAd－EGFP－T42腺病毒表達載體，并轉(zhuǎn)染Hek293細胞，觀察其對MCF－7乳腺癌細胞的凋亡和生長的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 Hek293細胞、pEC3.1(+)－EGFP質(zhì)粒、DH5a 大腸桿菌;pAd－BL－Dest菌液、LR Clonase Ⅱ、Lipofectamin 2000試劑盒、氨芐青霉素、卡那霉素及蛋白酶K(Invitrogen公司);Pac I等限制性內(nèi)切酶(Neb公司)、質(zhì)粒中提試劑盒和DNA回收凝膠試劑盒(長沙愛科博生物科技有限公司);細胞培養(yǎng)用的 DMEM、胰酶、胎牛血清、細胞培養(yǎng)板等(Gibco 公 司)。T42 引 物:前 向:5′－ATGCCGTTCTTATTCTGCAATG－3′;反向:5′－GGAGTTTGAGTAGTAGTTGCAC －3′。EGFP引物:前向:5′－TTTGAATTCATGGTGAGCAAGGGC－3′;反向:5′－TGGCTCGAGTTACTTGTACAGCTC－3′。引物由上海 Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 T42基因的獲得及四倍體T42肽(4T42)的構(gòu)建 人工合成 T42肽基因(序列參考文獻〔4〕)，5′端加上 BamH I酶切位點，3′端加上Bgl II－EcoR I酶切位點，由南京金斯瑞生物科技有限公司完成并克隆到pUC57載體(命名為pUC57－T42)。之后分別對pUC57－T42用BamH I/EcoR I雙酶切回收T42片段和BglⅡ/EcoR I雙酶切回收載體。用T4連接酶對T42片段和載體片段進行連接，鑒定陽性克隆后重復(fù)酶切連接一次，鑒定陽性的克隆就為 pUC57－4T42。

1.2.2 pEC3.1(+)－4T42重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用 BamH I和EcoR I分別雙酶切pUC57－4T42 PCR產(chǎn)物和pEC3.1(+)載體，回收T42片段和pEC3.1(+)載體片段，用T4 Ligase 16℃過夜連接。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5－alpha感受態(tài)，挑取單菌落搖菌，提取質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定。

1.2.3 pEC3.1(+)－EGFP－4T42重組質(zhì)粒的構(gòu)建 通過PCR擴增EGFP片段，EcoR I和Xho I分別雙酶切 PCR產(chǎn)物和pEC3.1(+)－EGFP－4T42 質(zhì)粒，回收后用 T4 Ligase 16℃ 過夜連接。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5－alpha感受態(tài)，挑取單菌落，搖菌，提取質(zhì)粒，進行EcoR I和Xho I雙酶切鑒定。

1.2.4 構(gòu)建pAd－EGFP－T42質(zhì)粒 通過LR體外同源重組將EGFP－4T42表達框轉(zhuǎn)移至 pAd－BL－Dest腺病毒表達載體上構(gòu)建pAd－EGFP －T42 質(zhì)粒。pEC3.1(+)－4T42－EGFP 3 μl，pAd－BLDest 1 μl，LR Clonase Ⅱ (Invitrogen)2 μl，補加 pH8.0 的 TE Buffer到總體積10 μl。放置到25℃水浴反應(yīng) 3 h。加入1 μl蛋白酶K到上步反應(yīng)體系中，37℃反應(yīng)15 min。將5 μl上步反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5а感受態(tài)細胞，均勻涂布于含Amp抗性(終濃度為100 μg/ml)的LB平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。從培養(yǎng)皿上挑取單克隆菌落接種于5 ml含 Amp抗性(終濃度為100 μg/ml)的LB培養(yǎng)液中，37℃，250 r/min培養(yǎng)過夜。用中提試劑盒提取質(zhì)粒，對提取的pAd－EGFP－4T42質(zhì)粒進行PCR鑒定:加入 10 倍 PCR Buffer 2.5 μl，rTaq(Takara)0.25 μl，dNTP(2.5 mmol/L)1 μl，T42 F(10 μmol/L)0.25 μl，T42R 0.25 μl，pAd－EGFP－T42 1 μl，補加 ddH2O 到總體積 25 μl。然后通過94℃ 5 min;94℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 50 s(共 30 個循環(huán));72℃10 min延伸后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶大小。對提取的 pAd－EGFP－4T42 質(zhì)粒進行酶切鑒定:取 pAd－EGFP－4T42 2 μl，Pac I Buffer 2 μl，Pac I 1 μl，補加水到 20 μl;放置到 37℃水浴3 h進行反應(yīng)后，進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.5 pAd－EGFP－4T42轉(zhuǎn)染Hek293細胞 用含10%胎牛血清、10 U/ml氨卞青霉素和10 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，6 cm細胞培養(yǎng)板，將細胞培養(yǎng)至密度為約50% ～70%，更換新鮮的不含血清的DMEM培養(yǎng)基;取4 μg重組鑒定正確的pAd－EGFP－4T42質(zhì)粒用 Pac I單酶切線性化后，加入培養(yǎng)基至250 μl，混勻為 A;將12 μl Lipo 2000 脂質(zhì)體加入238 μl培養(yǎng)基中，混勻為B;室溫5 min后，將A緩慢加入B中，室溫避光靜置20 min為C;慢慢將C加入細胞密度50% ～70%的Hek 293細胞培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光信號判斷rAd－EGFP－4T42是否包裝成功。

1.2.6 rAd－EGFP－4T42腺病毒的收集和擴增 繼續(xù)培養(yǎng)上步轉(zhuǎn)染成功的Hek293細胞，待出現(xiàn)明顯CPE，且有＞50%細胞脫壁時，即可收集細胞，離心加1 ml PBS并在－80℃和37℃水浴中反復(fù)凍融3次，每次凍融后，旋轉(zhuǎn)離心管1次，以使細胞懸液充分凍融，室溫下，12 000×g離心10 min，沉淀細胞碎屑，將上清液(主要成分為病毒原液)移入新的離心管中于－80℃。

將Hek23細胞接種于6孔板上，使每孔內(nèi)細胞數(shù)達到約7×105。吸去培養(yǎng)液，然后加入1 ml新鮮培養(yǎng)液，同時加入200 μl病毒原液混勻，37℃孵育2 h，再加入2 ml培養(yǎng)液繼續(xù)孵育。每日用熒光顯微鏡觀察情況。當(dāng)有病毒產(chǎn)生后即按上述方法收集病毒液。

1.2.7 rAd－EGFP－4T42腺病毒的鑒定 采用 RT－PCR方法鑒定。轉(zhuǎn)染后48 h，用Trizol抽提各孔細胞的總 RNA，以 Oligo(dT)為引物合成cDNA。然后以cDNA為模板，用T42F/R上下游引物行PCR檢測。

1.2.8 rAd－EGFP－4T42病毒滴度測定(熒光顯微鏡計數(shù)) 滴度測定前，以0.5×105濃度種細胞Hek293于24孔板，每孔1 ml細胞培養(yǎng)基，過夜(12 h)培養(yǎng)使細胞在板底部形成單層，此時細胞密度大約為1.0×105;取10 μl病毒液 +90 μl培養(yǎng)基，依次稀釋得到10－1～10－5病毒稀釋液。24孔板依次加入梯度稀釋的待測病毒樣品20 μl，留一孔作為對照不加病毒，培養(yǎng)2 d;熒光計數(shù):熒光顯微鏡下計數(shù)帶有熒光的細胞數(shù)目;計算病毒滴度:熒光細胞數(shù)目×稀釋倍數(shù)(10，102…105)/接種病毒量。

1.2.9 重組rAd－EGFP－4T42質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF－7乳腺癌細胞及其MTT 分析 實驗共設(shè)3 組:重組 rAd－EGFP－4T42 質(zhì)粒組、rAd－EGFP對照質(zhì)粒組、空白對照組。轉(zhuǎn)染前24 h取指數(shù)生長期的MCF－7乳腺癌細胞以4×105個細胞/孔分別接種到6孔板中。次日棄去原培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗2遍，加入1 ml 2%FBS的培養(yǎng)基，并用Lipo2000轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒到細胞中，6 h后換液并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，并分別取各組細胞2×104個/孔到96孔板中。分別于12、24、36、48 h對各組細胞進行MTT實驗。并計算各時間點質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相對于對照組的生長抑制率。

1.2.10 重組rAd－EGFP－4T42腺病毒感染SKBR3乳腺癌細胞及其流式細胞儀分析 實驗共設(shè)3組:重組腺病毒rAd－EGFP－4T42感染組、rAd－EGFP對照腺病毒感染組、空白對照組。根據(jù)文獻〔5〕的方法確定 MOI的值，將重組腺病毒 rAd－EGFP－4T42的最適MOI定為100。感染前24 h取指數(shù)生長期的SKBR3乳腺癌細胞細胞以4×105個細胞/孔，分別接種到各組的6孔板中。次日棄去原培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗2遍，加入1 ml 2%FBS的培養(yǎng)基，并加入100 MOI重組腺病毒或rAd－EGFP對照腺病毒，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，更換為新鮮完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后胰酶消化收集各孔細胞。

在雙變量流式細胞儀分析各組細胞，結(jié)果判斷方法如下:左下象限顯示活細胞，為(FITC－/PI－);右上象限是晚期凋亡細胞和壞死細胞，為(FITC+/PI+);而右下象限為早期凋亡細胞，呈現(xiàn)(FITC+/PI－)，左上象限代表細胞收集過程中出現(xiàn)的損傷細胞(FITC－/PI+)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 組間比較行χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 pUC57－4T42四倍體的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 將提取的pUC57－2T42、pUC57－4T42 質(zhì)粒用 BamH I/EcoR I雙酶切鑒定，得到大小分別為3 000、256、3 000、512 bp的片段，分別與載體和2T42(4T42)的大小相符。

2.2 pEC3.1(+)－EGFP－4T42雙酶切結(jié)果 將提取的pEC3.1(+)－EGFP－4T42 質(zhì)粒用 EcoR I/Xho I雙酶切鑒定，得到大小為5 046 bp和820 bp的片段，分別與pEC3.1(+)－4T42和EGFP的大小相符，說明結(jié)果正確。

2.3 pAd－EGFP－4T42 雙酶切鑒定結(jié)果 提取 pAd－EGFP－4T42質(zhì)粒用Pac I單酶切，得到大小約3 000 bp和大于15 kb的片段，說明質(zhì)粒為 pAd－BL－dest，即 pAd－EGFP－4T42 完全正確。

2.4 轉(zhuǎn)染rAd－EGFP－4T42的Hek293細胞熒光顯微鏡觀察結(jié)果 通過Lipo2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染rAd－EGFP－4T42的Hek293細胞轉(zhuǎn)染24 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果見圖1，說明轉(zhuǎn)染成功。

2.5 Hek293細胞中RT－PCR結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在128 bp處有清晰條帶。

圖1 質(zhì)粒rAd-EGFP-4T42轉(zhuǎn)染Hek293細胞的結(jié)果

2.6 Hek293細胞中的病毒物理滴度檢測結(jié)果 Hek293細胞中的病毒物理滴度檢測，以稀釋5次方的孔計算，每孔GFP陽性細胞共為82，則病毒滴度=4×108DRP/ml。

2.7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和對照組腫瘤細胞的MTT實驗結(jié)果 見圖2。rAd－EGFP－4T42質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，而rAd－EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與對照組相比差異不顯著。

圖2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與對照組相比的生長抑制率

2.8 流式細胞儀檢測SKBR3乳腺癌細胞凋亡率 空白對照組、對照腺病毒 rAd－EGFP感染組和重組腺病毒 rAd－EGFP－4T42感染組的凋亡率分別為11.6% ±2.2%、15.5% ±4.3%和38.9% ±4.4%。感染重組腺病毒rAd－EGFP－4T42的T24細胞較對照腺病毒感染細胞和未轉(zhuǎn)染空白組細胞凋亡率高，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

從肺－腎出血綜合征(Goodpasture)自身抗原發(fā)現(xiàn)Tumstatin有兩個功能位點:一個是C－末端的185～203位氨基酸組成的19肽，具有直接抑制腫瘤細胞增殖〔6〕，促進腫瘤細胞凋亡的作用〔7，8〕;另一個是接近N端的54～132位氨基酸組成的78肽，即tum－5片段，具有抗血管生成作用〔9〕。進一步研究證明，抗腫瘤血管生成活性區(qū)定位于74～98位氨基酸〔10〕，被稱為T7片段。目前利用－GG－柔性Linker將19肽和T7片段這兩個最小活性片段連接重組為T42肽，使其具有抗血管活性和抗腫瘤活性雙重作用的腫瘤抑素活性肽〔3〕。本文在構(gòu)建含4T42基因的腺病毒過程中，在熒光蛋白的指示下，能充分觀察到含目的基因的腺病毒基因組轉(zhuǎn)染 Hek293細胞的情況，在第7天觀察到大量Hek293細胞脫落、崩解，與文獻報道的一致〔11〕。與沒有熒光蛋白指示的轉(zhuǎn)染靠主觀判斷來決定病毒產(chǎn)生時間相比，充分保證了最高滴度病毒的獲取。熒光顯微鏡觀察具有綠色熒光說明EGFP片段進入Hek293細胞，RT－PCR結(jié)果說明了有4T42質(zhì)粒進入Hek293細胞，培養(yǎng)后檢測結(jié)果顯示具有熒光說明成功包裝出腺病毒，且該腺病毒具有感染能力。rAd－EGFP－4T42腺病毒的成功構(gòu)建和包裝以及功能研究的初步結(jié)果顯示，該腺病毒具有促進癌細胞凋亡的功能，且作用效果明顯。但其作用機制尚待進一步研究。

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