地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)化間二硝基苯為間硝基苯羥胺、間硝基苯胺和間苯二胺的研究

呂長維，陶黎明，徐文平

(1.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234；2.華東理工大學(xué)藥學(xué)院,上海 200237)

間二硝基苯的還原產(chǎn)物間苯二胺、間硝基苯胺都是重要的中間體，廣泛應(yīng)用于精細(xì)化工、制藥、染料以及農(nóng)藥工業(yè)；而且由間苯二胺與苯二甲酰氯合成的耐高溫芳香聚酰胺樹脂和阻燃纖維具有許多特殊用途(如用于防護(hù)服、航空航天材料等[1])，因此需求量大增。目前工業(yè)化生產(chǎn)芳香胺主要是利用有機合成中的一個重要單元反應(yīng)——芳香族硝基化合物的還原反應(yīng)，實際生產(chǎn)中已有許多經(jīng)典的方法，例如鐵粉還原、堿性條件下用磺化物還原、水合肼還原、電解還原以及催化加氫還原等等[2,3]，然而這些方法的反應(yīng)過程需要高壓、易燃?xì)錃狻⒂泻θ軇┗驎l(fā)生重金屬中毒等[4,5]。因此，高效安全地制備芳香胺依然是有機合成中的一個重要研究方向。

生物催化技術(shù)具有反應(yīng)條件溫和、專一性強等特點，受到越來越多的關(guān)注，并已廣泛應(yīng)用于制藥和精細(xì)化工領(lǐng)域。已有許多文獻(xiàn)報道了微生物降解環(huán)境中芳香族硝基化合物的研究[6,7]。Soojhawon等[8]利用AcinetobacterjuniiA8將對硝基苯酚、對硝基苯胺、對硝基甲苯、間硝基甲苯和2,4,6-三硝基甲苯等化合物在有氧條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，最終降解為直鏈化合物。Li等[9]則利用啤酒酵母制備芳基羥胺，反應(yīng)底物主要包括對二硝基苯、鄰二硝基苯、對甲磺基硝基苯等。但迄今未見利用微生物對間二硝基苯進(jìn)行轉(zhuǎn)化的報道。

在篩選具有還原芳香族硝基化合物能力的微生物的過程中，發(fā)現(xiàn)了一批細(xì)菌和放線菌具有還原硝基的能力，特別是1株地衣芽孢桿菌CGMCC2280，可以以間二硝基苯為底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。作者在此對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離、鑒定、轉(zhuǎn)化影響因素和轉(zhuǎn)化機制進(jìn)行了研究。

1 實驗

1.1 試劑和培養(yǎng)基

間硝基苯胺(純度≥98%)、間苯二胺(純度≥98%)，美國Aldrich公司；鄰二硝基苯(純度≥98%)，東京化成工業(yè)株式會社；鄰硝基苯胺(純度≥98.5%)，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；間二硝基苯、間硝基苯羥胺、對二硝基苯、對硝基苯胺，純度≥98%，常熟華泰化工廠；液相用甲醇、乙腈，色譜純，美國Merck公司；葡萄糖、蔗糖，市售分析純。

分離培養(yǎng)基Ⅰ(%)：葡萄糖1，酵母提取物0.5，可溶性淀粉2，碳酸鈣 1，N-amine 0.5，稀釋5倍后使用。

分離培養(yǎng)基Ⅱ(%)：可溶性淀粉0.5，葡萄糖0.5，蛋白胨0.1，酵母膏0.1，牛肉膏0.1。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：酵母浸膏10，蛋白胨10，氯化鈉10，氯化鈷0.005，磷酸氫二鉀0.05，氯化鎂0.005。

1.2 菌株的篩選和鑒定

將采集的土壤樣品用水稀釋后，涂布于分離培養(yǎng)基Ⅰ，28 ℃培養(yǎng)7 d后，挑選各單菌落分別培養(yǎng)于分離培養(yǎng)基Ⅱ。將配制好的間二硝基苯水溶液(200 mg·L-1)在100 ℃消毒20 min后，加入到預(yù)先配制并消毒的分離培養(yǎng)基Ⅱ中，使間二硝基苯終濃度為20 mg·L-1，倒入預(yù)先消毒的平皿中，待冷卻凝固后，將上述分離的不同的菌種接種于平皿中。培養(yǎng)皿在暗室中37 ℃放置48 h。然后在每個平皿中分別加入13 mL 0.21%的三氯乙酸溶液和0.007%的亞硝酸鈉溶液，室溫放置20 min。再加入1 mL 0.5%的氨基磺酸銨溶液，室溫下保溫3 min。最后在每個平皿中加入5 mL 0.1%的N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽溶液，室溫下仔細(xì)觀察平皿中的菌落，將染上紫紅色的菌株作為下一步復(fù)篩的備選菌[10]。

陽性菌株B.licheniformisCGMCC2280的培養(yǎng)特征、生理生化特征鑒定根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊[11]進(jìn)行。DNA提取及16S rDNA的擴(kuò)增和測序按文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行，將所測的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已有序列進(jìn)行分析比較，確定菌株的分類。

1.3 菌株的培養(yǎng)

將上述染色陽性菌株B.licheniformisCGMCC2280接種于LB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d，將培養(yǎng)好的菌種接種到已消毒的發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL搖瓶裝量50 mL，于37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)30 h左右。離心收集菌體，用磷酸緩沖溶液(50 mmol·L-1Na2HPO4/KH2PO4，pH值8.0)洗滌2次，然后用10 mL緩沖溶液混合均勻得靜息細(xì)胞懸浮液，供生物轉(zhuǎn)化用。

1.4 生物轉(zhuǎn)化

先將過量的間二硝基苯結(jié)晶加入磷酸緩沖溶液中使其飽和。在100 mL錐形瓶中加入20 mL上述飽和緩沖溶液和0.5 g葡萄糖，攪拌溶解后再加入5 mL靜息細(xì)胞懸浮液，在30 ℃下220 r·min-1搖床振蕩轉(zhuǎn)化20 h，離心(1000×g，15 min)除去菌體，上清液用于HPLC分析。同時設(shè)定無底物對照和無菌空白對照。

在轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間進(jìn)程實驗中，在指定的時間取樣0.1 mL,同樣處理后進(jìn)行HPLC分析。

在碳源影響實驗中，以不加葡萄糖為空白對照，分別用等量的蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖代替葡萄糖。以3次獨立實驗(每個實驗至少3個重復(fù))的平均值為實驗值。

1.5 HPLC分析

底物和產(chǎn)物的濃度測定采用HPLC法。

Agilent 1100型液相色譜儀，色譜條件：反相色譜柱(ODS C18,2.5 mm×20 mm,0.5 μm)，流動相為甲醇-乙腈-水混合液(35∶15∶50，體積比)，流速1 mL·min-1，檢測波長235 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.6 中間體和產(chǎn)物的大量制備

將B.licheniformisCGMCC2280斜面菌種接種于裝有300 mL已消毒LB培養(yǎng)基的1 L搖瓶中，于37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)20 h，接種到裝有10 L發(fā)酵培養(yǎng)基的自動發(fā)酵罐(BIOSTAT?C，B.Braun International，Germany)中，37 ℃下通氣(1∶0.4，體積比)攪拌(400 r·min-1)培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液用自動冷凍離心機(20PR-52D，HITACHI，Japan)離心(1000×g，15 min)后，將菌體懸浮在10 L轉(zhuǎn)化液(含2%葡萄糖的磷酸緩沖溶液，pH值8.0)中，加入2.5 g間二硝基苯，在14 L自動發(fā)酵罐中36～38 ℃攪拌轉(zhuǎn)化反應(yīng)。0.5 h后取1 L反應(yīng)液終止反應(yīng)，加入1 L氯仿萃取2次，合并萃取液，低溫減壓(15 ℃，0.096 MPa)濃縮得到固體，用甲醇溶解后進(jìn)一步用制備型HPLC[Shimadzu LC10A，甲醇-乙腈-水=35∶15∶50(體積比)]純化，低溫減壓(15 ℃，0.096 MPa)濃縮后得到217 mg化合物A(純度98.2%)。反應(yīng)2 h后再取1 L反應(yīng)液，同前操作，得到187 mg化合物B(純度99.4%)。反應(yīng)24 h后，用2.5 L乙酸乙酯萃取4次，合并有機相，減壓濃縮得到1.27 g近無色固體，在甲醇-苯混合液(5∶1，體積比)中重結(jié)晶，得到純度為98%以上的化合物C。

1.7 中間體和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

用LC-MS(Agilent LC/MSD)測定中間體和產(chǎn)物的質(zhì)譜；用NMR(Varian INOVA 400 MHz)測定中間體和產(chǎn)物的氫譜和碳譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株分離和鑒定

從500株菌中初篩出126株菌落染有紫紅色(表明菌落在生長時可能具有將間二硝基苯還原成間硝基苯胺或間苯二胺的能力)的菌株，再經(jīng)過液體發(fā)酵培養(yǎng)后進(jìn)一步進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化實驗，確認(rèn)19株菌株具有還原間二硝基苯的能力，其中1株菌株具有顯著的還原能力。該菌株菌體呈桿狀，培養(yǎng)36 h左右后產(chǎn)生芽孢，芽孢中生；營養(yǎng)瓊脂平板上，初期菌落呈光滑狀，后期呈列液狀，邊緣毛發(fā)褶皺。生理生化實驗表明該菌革蘭氏染色陽性，可水解明膠、淀粉，葡萄糖產(chǎn)酸，甲基紅實驗陽性，可耐受7%的氯化鈉和60 ℃高溫。16S rDNA(GenBank No.EU200968)分析表明，該菌與地衣芽孢桿菌的序列相似度為99%。綜合其形態(tài)和生理生化實驗結(jié)果判斷該菌株屬于地衣芽孢桿菌CGMCC2280(BacilluslicheniformisCGMCC2280)。

2.2 反應(yīng)中間體和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

LC-MS顯示化合物A分子量為154，1HNMR顯示在苯環(huán)上有4個氫，各氫位移值和歸屬為：7.25(1H，s，2-H)，7.46(1H，t,3J4-5=7.91，3J6-5=8.05，5-H)，7.80(1H，d,3J=7.91，4-H)，7.90(1H，d,3J=8.05,6-H)，位于低場的有2個活潑氫。從而推斷化合物A為間硝基苯羥胺。

化合物B和C分別與間硝基苯胺和間苯二胺標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間一致；LC-MS分析表明，它們的分子量和碎片峰也與標(biāo)準(zhǔn)品相同，1HNMR數(shù)據(jù)也一致。從而確定化合物B和C分別為間硝基苯胺和間苯二胺。

各化合物的1HNMR數(shù)據(jù)見表1。

表1 中間體和產(chǎn)物的1HNMR數(shù)據(jù)

2.3 底物選擇性

分別以間二硝基苯、間硝基苯胺、鄰二硝基苯、鄰硝基苯胺、對二硝基苯、對硝基苯胺6種化合物作為生物轉(zhuǎn)化的底物，考察菌株的底物選擇性，結(jié)果見表2。

由表2可看出，該菌株優(yōu)先轉(zhuǎn)化間位或鄰位二硝基底物，很難轉(zhuǎn)化對位二硝基底物。

表2 地衣芽孢桿菌對不同硝基化合物的選擇性還原

注：轉(zhuǎn)化率為被轉(zhuǎn)化底物的毫摩爾數(shù)與加入底物的毫摩爾數(shù)之比，用HPLC測定

2.4 pH值和溫度的影響

設(shè)定pH值為8.0、溫度為26～42 ℃，每隔2 ℃為一個區(qū)間，振蕩反應(yīng)20 h后，液相測定被轉(zhuǎn)化的底物量和產(chǎn)物的生成量，考察溫度對轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖1。設(shè)定溫度為37 ℃、pH值為4.5～10.0，振蕩反應(yīng)20 h后，液相測定被轉(zhuǎn)化的底物量和產(chǎn)物的生成量，考察pH值對轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 pH值和溫度對轉(zhuǎn)化率的影響

由圖1可看出，該菌株的最適反應(yīng)pH值為7.5～9.0，最適反應(yīng)溫度為30～38 ℃。

2.5 糖類的影響

地衣芽孢桿菌CGMCC2280轉(zhuǎn)化間二硝基苯反應(yīng)體系各物質(zhì)濃度與轉(zhuǎn)化時間的關(guān)系見圖2。

a.加2%葡萄糖 b.未加葡萄糖

由圖2可知，轉(zhuǎn)化液中添加2%的葡萄糖，有利于地衣芽孢桿菌對間二硝基苯的還原作用。在含有葡萄糖的轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中，轉(zhuǎn)化反應(yīng)初速度明顯比不加葡萄糖時要快，轉(zhuǎn)化4 h后產(chǎn)物間苯二胺的濃度仍然不斷增大，但增幅趨緩(圖2a)；在不加葡萄糖的轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中，轉(zhuǎn)化反應(yīng)初速度較慢，產(chǎn)物間苯二胺的最高濃度較低，尤其是反應(yīng)14 h后，濃度反而不斷減小(圖2b)。說明間二硝基苯的還原作用需要葡萄糖代謝提供能量和還原力，但該菌在沒有葡萄糖存在的情況下，可直接通過進(jìn)一步降解產(chǎn)物間苯二胺而維持反應(yīng)所需的能量。

2.6 溶劑對反應(yīng)進(jìn)程及反應(yīng)產(chǎn)物的影響

研究發(fā)現(xiàn)，甲醇、乙醇或丙酮的濃度超過20%時，可徹底終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。本實驗以丙酮為反應(yīng)抑制劑終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在不同時間加入丙硐對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響見表3。

表3 不同時間加入丙酮對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

注：底物初始濃度1.5 mmol·L-1；轉(zhuǎn)化率為減少的間二硝基苯毫摩爾數(shù)與投入反應(yīng)的間二硝基苯的毫摩爾數(shù)之比，用HPLC測定

由表3可看出，在反應(yīng)開始時加入丙酮，底物轉(zhuǎn)化率為1.3%，微量的間硝基苯羥胺可瞬間生成；在反應(yīng)0.5 h時加入丙酮，底物轉(zhuǎn)化率為91.3%，中間產(chǎn)物間硝基苯羥胺占91.2%，而間硝基苯胺只占產(chǎn)物的8.8%，無間苯二胺生成；在反應(yīng)2 h時加入丙酮，底物基本被轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達(dá)99.6%，主要產(chǎn)物為間硝基苯胺(占66.4%)，間硝基苯羥胺比例已降至12.1%，而間苯二胺則由0%上升至21.5%；在反應(yīng)8 h時加入丙酮，主要產(chǎn)物變?yōu)殚g苯二胺(占75.2%)，間硝基苯羥胺比例降至0%，而間硝基苯胺比例也降至24.8%。因此，可以確定地衣芽孢桿菌還原間二硝基苯的轉(zhuǎn)化過程是先形成間硝基苯羥胺，再形成間硝基苯胺，最后形成間苯二胺，如圖3所示。

圖3 地衣芽孢桿菌CGMCC2280轉(zhuǎn)化間二硝基苯的生物轉(zhuǎn)化過程

2.7 討論

目前，關(guān)于微生物進(jìn)行芳香族硝基還原研究的報道主要是集中于環(huán)境中芳香硝基化合物的微生物降解，如對三硝基甲苯(TNT)、硝基苯(MNT)以及2,4-二硝基甲苯(DNT)的降解研究[13,14]。Schenzle等[15]利用Ralstoniaeutropha菌產(chǎn)生的3NP硝基還原酶，對2-氯-5-硝基酚進(jìn)行化學(xué)選擇性還原，形成相應(yīng)的羥胺化合物，并對硝基苯、間二硝基苯、均三硝基苯、13種硝基酚、MNT、DNT和TNT等38種化合物進(jìn)行了底物適應(yīng)性比較，發(fā)現(xiàn)該酶對2-氨基-4-硝基甲苯的還原活性最高，與NADPH酶的相對活性為219；而對間二硝基苯的相對活性只有12。Li等[9]則利用啤酒酵母將對二硝基苯、鄰二硝基苯、對甲磺基硝基苯等轉(zhuǎn)化為羥胺，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物的比例與酵母的使用量有關(guān)，當(dāng)反應(yīng)底物濃度為100 mg·(100 mL)-1時，使用5 g干重的酵母可以使對二硝基苯近100%地還原為對硝基苯羥胺和對硝基苯胺，兩者的比例為95∶5，但對間二硝基苯的轉(zhuǎn)化作用未提及。Li等[16]還利用葡萄皮細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)選擇性還原芳香族硝基化合物來制備相應(yīng)的羥胺，進(jìn)行反應(yīng)的化合物有8-硝基-1,3-二氧基-苯基[de]吡喃、8-硝基-1,3-二氧基-苯基[de]-N-特丁基異喹啉、8-硝基-1,3-二氧基異吲哚、7-硝基-1,3-二氧基異吲哚、對二硝基苯和2-氰基-4-硝基苯腈，經(jīng)過6 d的轉(zhuǎn)化，前4種化合物轉(zhuǎn)化為羥胺均有較高的轉(zhuǎn)化率，而對后2種則無轉(zhuǎn)化效果，對間二硝基苯的轉(zhuǎn)化作用也未提及。本實驗首次報道了利用地衣芽孢桿菌還原間二硝基苯來制備間硝基苯羥胺、間硝基苯胺和間苯二胺的方法。而且根據(jù)丙酮對反應(yīng)的抑制作用原理，通過在不同的反應(yīng)時間添加丙酮終止反應(yīng)以控制反應(yīng)進(jìn)程，可以得到不同的反應(yīng)產(chǎn)物，以適應(yīng)不同的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物要求。根據(jù)反應(yīng)進(jìn)程可以確定本研究中地衣芽孢桿菌還原間二硝基苯的轉(zhuǎn)化過程是先形成間硝基苯羥胺，再進(jìn)一步形成間硝基苯胺，這一過程與其它芳香胺的形成原理基本一致[7,17～19]。

Blackie等[20]在研究酵母菌還原硝基和亞硝基化合物的過程中，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)條件不同可以發(fā)生2種不同類型的反應(yīng)，第一類型的反應(yīng)中加入糖可促進(jìn)胺類化合物的生成。Li等[9]在制備芳羥胺的反應(yīng)體系中也加入了2%的葡萄糖，但并未對葡萄糖的影響作說明。尹萍等[21]篩選了17株能夠降解TNT的酵母和類酵母菌，并發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加入一定量的碳、氮源可以促進(jìn)降解。李湛江等[22]利用吉氏擬桿菌和尿擬桿菌與葡萄糖共代謝降解硝基苯，但在不加葡萄糖的情況下降解活性為零，認(rèn)為這是由于這些菌株不能以硝基苯為唯一碳源的緣故。而本實驗中的地衣芽孢桿菌即使在沒有葡萄糖的情況下，開始也能將底物迅速降解，只是隨后將部分產(chǎn)物降解，以維持菌體活力而導(dǎo)致產(chǎn)物生成率下降。因此，在利用地衣芽孢桿菌CGMCC2280轉(zhuǎn)化制備間硝基苯胺，尤其是間苯二胺的時候，需要加入少量的葡萄糖等碳源，以提高轉(zhuǎn)化率，同時可以避免產(chǎn)物被進(jìn)一步降解。

根據(jù)B.licheniformisCGMCC2280的轉(zhuǎn)化進(jìn)程，可以清楚地發(fā)現(xiàn)該菌在轉(zhuǎn)化間二硝基苯的過程中，將間二硝基苯還原為間硝基苯羥胺是一步快速的酶促反應(yīng)，無論葡萄糖是否加入，都不影響這步反應(yīng)的進(jìn)行。但是正如溶劑影響實驗中所揭示的那樣，由于丙酮對細(xì)胞間二硝基苯還原酶具有抑制作用，因此在各反應(yīng)階段加入丙酮等溶劑后，即可終止反應(yīng)。據(jù)此在轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行0.5 h后加入丙酮溶劑終止反應(yīng)，可以很方便地得到中間產(chǎn)物間硝基苯羥胺，而不會產(chǎn)生過多的間硝基苯胺和間苯二胺，這也為制備采用化學(xué)合成手段難以得到的間硝基苯羥胺提供了一條新的途徑。

Li等[9]認(rèn)為酵母菌對底物的選擇性與苯環(huán)上所連接基團(tuán)的特性有關(guān)，基團(tuán)吸電性越強，轉(zhuǎn)化越容易進(jìn)行；如果是供電子基團(tuán)則轉(zhuǎn)化無法進(jìn)行。但是本實驗結(jié)果卻表明底物選擇性與基團(tuán)的吸電性沒有顯著的相關(guān)性，如鄰二硝基苯和對二硝基苯的電子云分布相似，但地衣芽孢桿菌CGMCC2280對兩者的轉(zhuǎn)化率卻有很大的差別；即使對鄰硝基甲苯這樣有供電子基團(tuán)的化合物，該菌依然具有很好的轉(zhuǎn)化活性(數(shù)據(jù)未列出)。這些結(jié)果表明地衣芽孢桿菌CGMCC2280對底物的選擇性主要與化合物的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。

3 結(jié)論

從土壤中篩選得到1株轉(zhuǎn)化間二硝基苯的芽孢桿菌，經(jīng)生理生化實驗及16S rDNA序列分析，確定其為地衣芽孢桿菌CGMCC2280。對含間二硝基苯的菌體轉(zhuǎn)化液在不同時間取樣，分離純化得到化合物A、B和C，通過LC-MS和1HNMR分析，同時與標(biāo)準(zhǔn)品對照，確定化合物A、B和C分別為間硝基苯羥胺、間硝基苯胺和間苯二胺。底物特異性表明，該菌對間二硝基苯和鄰二硝基苯的底物轉(zhuǎn)化率10 h達(dá)到98%以上，但對對二硝基苯的底物轉(zhuǎn)化率卻不到10%。轉(zhuǎn)化液中葡萄糖具有促進(jìn)間二硝基苯還原的作用，在沒有葡萄糖存在的情況下，轉(zhuǎn)化反應(yīng)速度較慢，且反應(yīng)后期反應(yīng)產(chǎn)物間苯二胺會進(jìn)一步降解。在轉(zhuǎn)化反應(yīng)的不同時間加入丙酮終止反應(yīng)并進(jìn)行產(chǎn)物分析，發(fā)現(xiàn)該菌還原間二硝基苯的轉(zhuǎn)化過程是先形成間硝基苯羥胺，再形成間硝基苯胺，最后形成間苯二胺。

(致謝:感謝華東理工大學(xué)李忠教授在核磁共振測定方面的幫助!感謝上海南方農(nóng)藥研究中心陸迪生先生在LC-MS測定中給予的幫助!)

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