Klebsiella oxytoca EN-B2高效轉(zhuǎn)化羥胺和亞硝態(tài)氮的影響因素研究

摘要：羥胺和亞硝態(tài)氮對(duì)動(dòng)植物具有毒害作用，并通過(guò)污染環(huán)境進(jìn)一步危害人類健康。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期分離獲得的一株高效轉(zhuǎn)化羥胺和亞硝態(tài)氮的克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca ）為研究對(duì)象，探究不同環(huán)境因素對(duì)該菌株同時(shí)去除羥胺和亞硝態(tài)氮的影響。結(jié)果表明，在碳源為丁二酸鈉，接菌量0.4×10⁸ CFU、碳氮比（C/N）15、溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min和初始pH值8.0條件下，菌株EN-B2對(duì)羥胺、亞硝態(tài)氮、總氮的去除效率最高，去除率分別達(dá)到了99.42%、100.00%和87.76%。此外，本研究通過(guò)向亞硝態(tài)氮體系中添加不同濃度的羥胺，進(jìn)一步探討了羥胺對(duì)菌株EN-B2反硝化過(guò)程的影響。結(jié)果表明，當(dāng)體系中羥胺濃度超過(guò)3 mg/L后，隨著羥胺濃度的進(jìn)一步增加，該菌株在相同時(shí)間下亞硝態(tài)氮去除速率降低。本研究有助于理解Klebsiella oxytoca EN-B2在羥胺和亞硝態(tài)氮混合體系中的除氮特性，為氮污染廢水的處理工藝提供重要參考。

關(guān)鍵詞：Klebsiella oxytoca；羥胺；亞硝態(tài)氮；環(huán)境因素

中圖分類號(hào)：X523文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A隨著農(nóng)業(yè)和工業(yè)現(xiàn)代化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，氮肥的過(guò)度施用、未經(jīng)恰當(dāng)處理的工業(yè)廢水排放和垃圾濾液的滲漏等問(wèn)題日益嚴(yán)重［1］，導(dǎo)致湖泊、水庫(kù)和河流等水源遭受?chē)?yán)重污染［2］?！吨袊?guó)生態(tài)環(huán)境狀況公報(bào)》發(fā)布的2021年我國(guó)209個(gè)重要湖泊（水庫(kù)）的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示，貧營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)湖泊（水庫(kù)）占10.5%，中營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)占62.2%，輕度富營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)占23.0%，中度富營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)占4.3%［3］。其中，氮污染在水體富營(yíng)養(yǎng)化中最為突出，污染物主要為銨、羥胺、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮［4-6］，其中，羥胺和亞硝態(tài)氮是硝化過(guò)程的中間產(chǎn)物［7-8］，均具有極強(qiáng)的毒性。人體攝入過(guò)多羥胺和亞硝態(tài)氮易生成高鐵血紅蛋白從而誘發(fā)肝癌、食管癌以及胃癌［9］等疾病，嚴(yán)重威脅到人類公共衛(wèi)生安全。

氮污染廢水的處理技術(shù)主要包括物理法、化學(xué)法和生物法。其中，微生物驅(qū)動(dòng)的生物脫氮工藝具備效率高、成本低和無(wú)二次污染等特點(diǎn)而備受關(guān)注，已成為污水處理廠主流的脫氮方式［10］。在生物脫氮過(guò)程中，羥胺的適量投放會(huì)對(duì)反應(yīng)器脫氮效率及微生物生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用［11］。然而，羥胺排放到環(huán)境中會(huì)對(duì)植物造成危害，且過(guò)量的羥胺還會(huì)抑制微生物生長(zhǎng)，進(jìn)而降低脫氮效率［12］。研究高效轉(zhuǎn)化羥胺的微生物有助于降低羥胺的毒害作用，其中，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化（HN-AD）細(xì)菌的分離鑒定和生理特性等是目前的研究熱點(diǎn)［13］，如異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌Klebsiella michiganensis MF1［14］和Klebsiella pneumoniae CF-S9［15］在單一氮源試驗(yàn)中均表現(xiàn)出良好脫氮特性，而對(duì)于HN-AD細(xì)菌在羥胺和亞硝態(tài)氮混合氮源中進(jìn)行脫氮的相關(guān)研究較為缺乏。

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期分離篩選獲得的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株Klebsiella oxytoca EN-B2為研究對(duì)象，通過(guò)使用不同接菌量、碳氮比（C/N）、培養(yǎng)溫度、溶解氧、碳源和初始pH值，探究了該菌株對(duì)羥胺和亞硝態(tài)氮混合體系的最佳去除條件。此外，通過(guò)控制體系中羥胺的添加量，揭示不同濃度的羥胺對(duì)EN-B2的亞硝酸鹽去除能力的影響。本研究結(jié)果揭示了影響菌株EN-B2去除羥胺和亞硝態(tài)氮的關(guān)鍵因素，為生物脫氮工藝的優(yōu)化提供科學(xué)指導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)耐羥胺菌株的研究和實(shí)際應(yīng)用具有重要意義，以期為開(kāi)發(fā)更高效的脫氮菌株和污水處理工藝的改進(jìn)提供實(shí)用方案。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來(lái)源

實(shí)驗(yàn)室前期已分離篩選的具備高效除羥胺性能的菌株Klebsiella oxytoca EN-B2［16］。

1.1.2培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基（g/L，pH 7.2）：氯化鈉10.0 g，酵母浸粉5.0 g，胰蛋白胨10.0 g。

培養(yǎng)條件優(yōu)化培養(yǎng)基（g/L， pH 7.2）： NaNO₂ 0.246 g，NH₂OH·HCl 0.0496 g，KH₂PO₄ 1.5 g，K₂HPO₄ 3.5 g，MgSO4 0.04 g，GaCl2 0.014 g，F(xiàn)e2（SO4）3 0.009 g，檸檬酸鈉 3.676 g，丁二酸鈉2.025 g，葡萄糖 2.252 g，蔗糖 4.278 g，乙酸鈉1.625 g，酒石酸鉀 3.528 g。

滅菌條件：121 ℃、0.11 MPa條件下加熱滅菌30 min。

1.2培養(yǎng)條件對(duì)菌株EN-B2脫氮能力的影響

取1 mL甘油菌液接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床中活化36 h。將3 mL活化后的菌懸液轉(zhuǎn)接至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行48 h的擴(kuò)大培養(yǎng)。將擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌懸液離心5 min（6 500 r/min，25 ℃），用40 mL滅菌超純水洗滌2次，再用無(wú)菌水重懸菌體。調(diào)整菌密度D₆₀₀值至0.5×10⁸ CFU/mL，從而使菌株初始細(xì)菌濃度為0.5×10⁸ CFU/mL，隨后接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中，25 ℃下?lián)u床振蕩培養(yǎng)30 h后，取離心后的上清液于試管中，檢測(cè)總氮、亞硝態(tài)氮、羥胺、D₆₀₀、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、及pH值。羥胺采用8-羥基喹啉紫外分光光度法、亞硝態(tài)氮采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法、銨氮采用靛酚藍(lán)紫外分光光度法、硝態(tài)氮采用紫外分光度法和總氮采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法［17］。

培養(yǎng)條件優(yōu)化培養(yǎng)基以羥胺和亞硝態(tài)氮為混合氮源，分別設(shè)置不同的細(xì)菌濃度（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和7×10⁸ CFU/mL）、C/N比例（5、10、15、20和25）、溫度（5、10、15、20、25和30 ℃）、轉(zhuǎn)速（0、50、100、150和200 r/min）、碳源種類（檸檬酸鈉、丁二酸鈉、葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉和酒石酸鉀鈉）和pH值（6.0、7.0、8.0、9.0和10.0），搖床培養(yǎng)30 h，分別檢測(cè)0 h和30 h時(shí)培養(yǎng)基中的總氮、羥胺、亞硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮濃度、pH值和D₆₀₀值，以此計(jì)算總氮、羥胺和亞硝態(tài)氮在30 h內(nèi)的去除效率，氮去除率計(jì)算公式：Ef=（R1-R2）/R1［18］（R1和R2分別表示初始氮濃度和最終氮濃度），進(jìn)而評(píng)估不同因素對(duì)菌株EN-B2的生長(zhǎng)及脫氮的影響，篩選菌株脫氮的最適培養(yǎng)條件。

1.3羥胺對(duì)菌株EN-B2去除亞硝態(tài)氮的影響

培養(yǎng)基中添加的初始亞硝態(tài)氮濃度固定為50 mg/L，設(shè)置羥胺濃度分別為0、1、3、5、7和9 mg/L。根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果設(shè)置培養(yǎng)條件，每隔6 h取樣測(cè)定D₆₀₀值、亞硝態(tài)氮及總氮吸光度，無(wú)機(jī)氮去除率計(jì)算公式同1.2，計(jì)算羥胺和亞硝態(tài)氮的去除情況，從而評(píng)估羥胺對(duì)菌株EN-B2去除亞硝態(tài)氮的影響。所有試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行。

2結(jié)果與討論

2.1接種量對(duì)菌株EN-B2脫氮的影響

接菌量的大小是影響菌株脫氮效率的重要因素之一，接種量過(guò)低會(huì)導(dǎo)致在一定時(shí)間內(nèi)菌體密度較低，從而導(dǎo)致菌體脫氮效果不佳，但接種量過(guò)多反而會(huì)引起菌株競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)菌死亡從而降低脫氮效率［19］。因此，探究最適接菌量有助于提高菌株EN-B2的好氧反硝化脫氮效率，也能為實(shí)際應(yīng)用提供參考。接菌量對(duì)菌株EN-B2脫氮性能的影響如圖1（a）所示，當(dāng)EN-B2的細(xì)菌濃度從0.2×108 CFU/mL逐漸增加至0.4×10⁸ CFU/mL時(shí)，羥胺的去除率分別74.40%、86.52%和93.76%，亞硝態(tài)氮去除率分別為90.09%、97.82%和100.00%，總氮去除率分別為23.07%、62.06%和88.17%，D₆₀₀值分別為0.29、1.24和1.24，此過(guò)程無(wú)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮積累（圖1（b））。表明在一定接種量范圍內(nèi)，相同作用時(shí)間和條件下，菌株接種量越大無(wú)機(jī)氮去除效果越好，這是因?yàn)榻臃N量大，菌株產(chǎn)生的脫氮相關(guān)酶越多，氮去除效果越好，與邱曉帆［20］的研究結(jié)果一致。此外，隨著接菌量的繼續(xù)增加，總氮與羥胺去除率均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。當(dāng)細(xì)菌濃度為0.5×10⁸、0.6×10⁸和0.7×10⁸ CFU/mL時(shí)，羥胺的去除率為93.76%、88.74%和64.96%，總氮去除率分別為87.29%、83.47%和80.74%，D₆₀₀值分別為1.27、0.59和0.28。結(jié)果表明過(guò)高的接種量抑制了菌株EN-B2的氮去除能力，這可能是由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏不能滿足菌株的生長(zhǎng)繁殖所致，但亞硝態(tài)氮仍可被完全去除?？梢钥闯鲈诮泳繛?.4×10⁸ CFU/mL時(shí)，菌株EN-B2對(duì)TN和羥胺的去除率最高，同時(shí)亞硝態(tài)氮的去除率也高達(dá)100.00%。與此同時(shí)，未檢測(cè)到硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的積累（圖1（b））。結(jié)合羥胺去除率、亞硝酸鹽去除率和總氮去除率，菌株EN-B2脫氮的最適接菌量被確定為0.4×10⁸ CFU/mL。

2.2C/N比對(duì)菌株EN-B2脫氮的影響

碳源和氮源是微生物生長(zhǎng)和代謝的必需元素，碳源是微生物的結(jié)構(gòu)單元和能量來(lái)源，而氮源則參與氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸的合成［21］。C/N比對(duì)微生物好氧反硝化過(guò)程具有極大的影響，當(dāng)碳源的含量較低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌能量不足而死亡，影響反硝化效率［22］，但實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中過(guò)高的碳源需求則會(huì)導(dǎo)致成本升高。

本研究對(duì)菌株EN-B2在不同C/N比條件下的羥胺和亞硝態(tài)氮去除率進(jìn)行探究。結(jié)果如圖2（a）所示，在C/N比為5時(shí)，菌株EN-B2在30 h內(nèi)對(duì)羥胺、亞硝態(tài)氮和總氮的去除率分別為89.01%、32.68%和21.86%，當(dāng)C/N比為10時(shí)，羥胺、亞硝態(tài)氮和總氮的去除率分別為87.46%、73.25%和59.79%，當(dāng)C/N為15、20和25時(shí)，亞硝態(tài)氮被完全去除，表明較高的C/N比促進(jìn)了菌株EN-B2的亞硝態(tài)氮去除。隨著C/N比的增加，羥胺去除率從C/N比為15時(shí)的93.03%降至C/N比為20時(shí)的87.04%，但當(dāng)C/N比提升至25時(shí)去除率升至90.15%?？偟コ蕪腃/N比為15時(shí)的91.61%提升到C/N比為20時(shí)的最大值92.06%，但當(dāng)C/N比上升至25時(shí)，總氮的去除率降至90.14%，考慮到C/N比為15和20時(shí)亞硝態(tài)氮去除效率和總氮去除率接近，且均達(dá)到91%以上，且此時(shí)銨態(tài)氮和銷態(tài)氮的積累量較低（圖2（b）），同時(shí)羥胺去除率在C/N比為15時(shí)最大。因此綜合成本、羥胺去除率、亞硝態(tài)氮去除率和細(xì)胞生長(zhǎng)速率等多種因素，確定菌株EN-B2去除亞硝態(tài)氮的最適C/N比為15。本研究的結(jié)果與菌株Acinetobacter sp. T1［23］（最佳C/N比為10）和菌株Alcaligenes faecalis TF-1［24］（最佳C/N比為16）的研究結(jié)果均不一致，表明不同菌株脫氮的最佳C/N比具有差異性，篩選最佳C/N比對(duì)于優(yōu)化菌株脫氮性能具有重要意義。

2.3溫度對(duì)菌株EN-B2脫氮的影響

溫度是影響脫氮過(guò)程的關(guān)鍵因素之一，其主要通過(guò)影響脫氮關(guān)鍵酶活性來(lái)影響菌株的氮代謝效果。本研究以亞硝態(tài)氮和羥胺制備混合氮源，探究菌株EN-B2在不同溫度下的氮去除能力。結(jié)果如圖3所示，在20～30 ℃的溫度范圍內(nèi)，菌株EN-B2均能正常生長(zhǎng)，且具備去除羥胺和亞硝態(tài)氮的能力。當(dāng)溫度從5 ℃升高到15 ℃，該菌株對(duì)羥胺的去除率從89.31%逐漸升高至98.12%，而亞硝態(tài)氮去除率從3.60%降至0.00%后又升至21.09%，此時(shí)銨態(tài)氮濃度從1.02 mg/L小幅升至1.17 mg/L，硝態(tài)氮濃度從8.74 mg/L降至6.36 mg/L后又升至8.43 mg/L。當(dāng)溫度升至20 ℃時(shí)，菌株EN-B2的亞硝態(tài)氮和總氮去除率大幅度上升，分別達(dá)到了84.59%和62.33%，羥胺的去除率為91.77%，此時(shí)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮濃度分別為1.42 mg/L和7.62 mg/L。隨著溫度的進(jìn)一步升高，亞硝態(tài)氮和總氮去除率均在25 ℃時(shí)達(dá)到最高，分別為100.00%和80.63%，羥胺去除率為98.00%，此時(shí)銨態(tài)氮積累處于較低水平為2.28 mg/L，而硝態(tài)氮為8.31 mg/L。

綜合不同溫度下亞硝態(tài)氮、羥胺和總氮的去除效率，菌株EN-B2生長(zhǎng)及去除羥胺和亞硝態(tài)氮的最佳溫度為25 ℃。在5～15 ℃內(nèi)，僅羥胺的去除效率處于較高水平，而亞硝態(tài)氮和總氮的去除效率極低，且溫度越低，氮去除效率越低，推測(cè)原因?yàn)槊摰^(guò)程的關(guān)鍵酶活性在低溫條件下受到一定的抑制，這與菌株Acinetobacter sp.ND7［25］和Acinetobacter calcoaceticus TY1［26］的結(jié)果相似。

2.4溶解氧對(duì)菌株EN-B2脫氮的影響

溶解氧是同步硝化反硝化過(guò)程的重要影響因素［27］，其作為反硝化過(guò)程的電子受體，不同水平的溶解氧會(huì)對(duì)細(xì)菌的脫氮效率產(chǎn)生不同的影響［28］，為探究溶解氧對(duì)菌株EN-B2脫氮作用的影響，本研究分別設(shè)置溶解水平為0、50、100、150和200 r/min。如圖4（a）所示，隨著溶解水平從0 r/min增加到100 r/min，菌株EN-B2對(duì)羥胺的去除率由90.51%升至93.43%，而亞硝態(tài)氮和總氮的去除率分別從0.00%和0.00%大幅增至100.00%和85.21%，當(dāng)溶解水平增加至150 r/min時(shí)，總氮、羥胺以及亞硝態(tài)氮的去除率均達(dá)到峰值，分別為85.58%、97.05%和100.00%，表明菌株EN-B2對(duì)總氮降解能力在一定范圍內(nèi)隨著轉(zhuǎn)速的提高而增強(qiáng)。然而，當(dāng)轉(zhuǎn)速增加到200 r/min時(shí)，總氮的降解率有所下降，可能是由于較高的轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)菌活性產(chǎn)生了不良影響。上述結(jié)果表明，溶解氧對(duì)菌株EN-B2的羥胺與亞硝態(tài)氮去除能力具有較大影響，而該菌株去除混合氮源的最適溶解氧水平為150 r/min。

2.5 碳源對(duì)菌株EN-B2脫氮的影響

不同的碳源通常具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子量，并且能作為生物脫氮過(guò)程中的電子供體和能量來(lái)源，通常結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單、分子量小的碳源更容易被微生物利用［29］。本研究探索了不同碳源對(duì)菌株EN-B2去除羥胺與亞硝態(tài)氮的影響。如圖5（a）所示，碳源對(duì)菌株EN-B2去除混合氮具有顯著的影響。以葡萄糖作為碳源時(shí)，菌株EN-B2對(duì)羥胺的去除率幾乎為零，而對(duì)亞硝態(tài)氮和總氮的去除率分別為100.00%和85.21%；而以檸檬酸鈉、乙酸鈉和酒石酸鉀鈉為碳源時(shí)，菌株EN-B2在30 h內(nèi)對(duì)亞硝態(tài)氮和總氮的去除率幾乎為零，對(duì)羥胺的去除率分別為84.78%、100.00%和80.28%，且它們?yōu)樘荚磿r(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)最緩慢；當(dāng)以丁二酸鈉和蔗糖為碳源時(shí)，菌株對(duì)羥胺、亞硝態(tài)氮、總氮均具有去除能力，效率分別為100.00%、100.00%、89.13%和92.12%、100.00%、88.15%。且以丁二酸鈉為碳源時(shí)，無(wú)銨態(tài)氮的積累，硝態(tài)氮為5.62 mg/L（如圖5（b））。以上結(jié)果表明，菌株EN-B2可以利用不同碳源去除羥胺與亞硝態(tài)氮，尤其是以丁二酸鈉作為碳源時(shí)，羥胺、亞硝態(tài)氮和總氮的去除率均最高，因此，丁二酸鈉是菌株EN-B2去除硝態(tài)氮的最適碳源。試驗(yàn)結(jié)果表明不同碳源對(duì)菌株EN-B2去除羥胺、亞硝態(tài)氮和總氮有不同程度的影響，推測(cè)其原因是微生物對(duì)不同分子量和結(jié)構(gòu)的碳源的利用存在一定的偏好性［30］，使得微生物在不同碳源下表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)情況和氮去除特性。

2.6初始pH值對(duì)菌株EN-B2脫氮的影響

pH值在微生物的生長(zhǎng)和代謝中起著至關(guān)重要的作用，通常細(xì)菌在不適的pH環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致菌體中多種酶的活性降低，從而降低微生物的代謝能力［31］。因此，探究初始pH值與菌株EN-B2轉(zhuǎn)化羥胺與亞硝態(tài)氮的關(guān)系非常重要。如圖6（a）所示，不同初始pH值條件對(duì)菌株EN-B2的羥胺、亞硝態(tài)氮和總氮去除效率均有影響。當(dāng)初始pH值控制在6.0、7.0、8.0、9.0和10.0時(shí)，亞硝態(tài)氮均被完全去除，羥胺的去除率分別為77.71%、94.92%、99.42%、99.74%和99.98%，總氮去除率分別為86.49%、85.72%、87.08%、88.25%和87.98%，無(wú)硝態(tài)氮的積累且銨態(tài)氮的積累處于較低水平（如圖6（b）），表明菌株EN-B2具有較大的pH值適應(yīng)范圍，這與LEI等人[32]的研究結(jié)論一致。堿性環(huán)境比酸性環(huán)境更有利于菌株EN-B2除氮，當(dāng)pH值為8.0、9.0和10.0時(shí)，其總氮、羥胺和亞硝態(tài)氮的去除效率較pH為6.0時(shí)更高，綜合經(jīng)濟(jì)成本、實(shí)際環(huán)境條件，確定菌株EN-B2菌株EN-B2是一種喜堿性細(xì)菌，其進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖及脫氮作用的最適pH值為8.0。

2.7羥胺對(duì)亞硝態(tài)氮去除的影響

羥胺是一種抑制劑［33］，具有極強(qiáng)的毒性，其不僅對(duì)植物的生長(zhǎng)繁殖會(huì)產(chǎn)生毒害作用，同時(shí)還會(huì)通過(guò)抑制微生物的生長(zhǎng)，從而降低微生物的脫氮效率［34］，使得污水脫氮處理達(dá)不到理想效果。

為研究羥胺對(duì)菌株EN-B2去除亞硝態(tài)氮的影響，將不同濃度的羥胺添加到含有50 mg/L亞硝態(tài)氮的培養(yǎng)基中，每隔6 h取樣檢測(cè)培養(yǎng)基中羥胺和亞硝態(tài)氮濃度。結(jié)果如圖7（a）和（b）所示，當(dāng)初始羥胺濃度分別為0和1 mg/L時(shí)，6 h時(shí)，亞硝酸鹽的去除效率分別為25.18%和6.34%，此時(shí)羥胺濃度分別為0.00 mg/L和0.02 mg/L，而在初始羥胺濃度大于3.0 mg/L時(shí)，亞硝態(tài)氮的濃度均略微上升。菌株培養(yǎng)至12 h時(shí)，在0和1 mg/L的羥胺濃度下，亞硝酸鹽的去除率分別增至69.19%和59.90%，此時(shí)羥銨均完全去除，同時(shí)在3 mg/L的羥胺作用下，亞硝酸鹽也出現(xiàn)了去除的現(xiàn)象，但去除效率僅為32.70%，而5、7和9 mg/L 的羥胺嚴(yán)重抑制了亞硝酸鹽的去除。由圖7（b）和（c）可知，在12～18 h，羥胺濃度和菌株生長(zhǎng)呈現(xiàn)反比關(guān)系，這與李健弟［11］、WANG［35］和LI等人的［36］研究結(jié)果一致，均顯示羥胺的添加會(huì)導(dǎo)致亞硝態(tài)氮的積累量增加，表明亞硝態(tài)氮的去除率與羥胺濃度在一定范圍內(nèi)呈反比關(guān)系。如圖7（d）所示，當(dāng)菌株EN-F2培養(yǎng)至30 h時(shí)，所有羥胺濃度條件下的亞硝態(tài)氮均被完全去除。在不同濃度羥胺添加條件下，該菌均能快速去除亞硝態(tài)氮，與對(duì)照組相比（4.27 mg/L/h），當(dāng)羥胺為1.0 mg/L時(shí)，該菌對(duì)亞硝態(tài)氮去除速率最大，在6～12 h期間達(dá)到了4.70 mg/L/h表明低濃度的羥胺可提高菌株EN-B2對(duì)亞硝態(tài)氮的去除速率。

3結(jié)論與展望

3.1結(jié)論

克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca） EN-B2可在廣泛的pH（7.0～10.0）和C/N比（10～30）范圍高效去除羥胺和亞硝態(tài)氮，單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株EN-B2去除羥胺與亞硝態(tài)氮的最適接種濃度為0.4×108 CFU/mL、C/N為15、溫度為25 ℃、溶解氧水平為150 r/min、碳源是丁二酸鈉、初始pH為8.0；不同濃度羥胺添加對(duì)菌株EN-B2去除亞硝態(tài)氮的速率具有顯著的影響，隨著羥胺的濃度由0 mg/L增加至9.0 mg/L，總氮的去除率由100.00%逐漸降至76.12%；當(dāng)羥胺濃度超過(guò)3.0 mg/L后，菌株EN-B2的亞硝態(tài)氮去除隨羥胺濃度上升逐漸受到抑制，完全去除等量亞硝態(tài)氮所需時(shí)間越長(zhǎng)。上述結(jié)果表明，菌株EN-B2對(duì)于廢水中的羥胺和亞硝態(tài)氮具有良好的凈化潛力。

3.2展望

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期分離篩選獲得的菌株EN-B2為材料，分析不同因素對(duì)其在羥胺與亞硝態(tài)氮混合體系中的脫氮效果的影響，優(yōu)化了菌株EN-B2的最適反應(yīng)條件，通過(guò)研究不同濃度羥胺對(duì)菌株EN-B2去除亞硝態(tài)氮的影響，揭示該菌株具有的高效反硝化能力，明確了羥胺與菌株去除亞硝態(tài)氮的關(guān)系。本研究可為生物法去除羥胺與亞硝態(tài)氮的混合氮源以及污水處理提供參考，但仍然存在一些不足有待后續(xù)研究：

（1）本文研究了菌株EN-B2的脫氮特性，但未能闡明其脫氮機(jī)理，后續(xù)研究可對(duì)除氮過(guò)程中是否會(huì)產(chǎn)生N2O和脫氮功能基因進(jìn)行研究，探索微生物除氮機(jī)制；

（2）本研究對(duì)菌株EN-B2脫氮特性的探索僅限于試驗(yàn)條件下，未在實(shí)際環(huán)境中應(yīng)用，后續(xù)研究應(yīng)注重在實(shí)際生活污水中的研究，以準(zhǔn)確評(píng)估菌株EN-B2的實(shí)際應(yīng)用能力。參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯：于慧梅）

Study on the Characteristics of Efficient Conversion of Hydroxylamine

and Nitrite by Klebsiella Oxytoca EN-B2

ZOU Jianguo XU Xingzhou" WANG Ying TIAN Shan" WANG Xiaoqiang WANG Jiachen

CHEN Chan ZOU Ting， HE Tengxia" JIANG Long

（1.College of Life Sciences， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 2.Key Laboratory of Plant Resource Conservation and

Germplasm Innovation in Mountainous Region （Ministry of Education）， Guizhou University， Guiyang 550025， China）Abstract： Hydroxylamine and nitrite are toxic to plants and animals， and can further endanger human health through polluted environment. In this study， a strain of Klebsiella oxytoca EN-B2 with efficiently ability to convert hydroxylamine and nitrite was used， which isolated in our previous study. Exploring the effects of environmental factors on the removal of hydroxylamine and nitrite. The results show that EN-B2 remov hydroxylamine， nitrite and total nitrogen most efficiently under the conditions of sodium succinate as carbon source， 0.4×108 CFU/mL， carbon-nitrogen ratio （C/N） of 15， temperature of 25 ℃， rotation speed of 150 r/min and initial pH of 8.0. It with removal rates of 99.42%， 100.00% and 87.76%， respectively. In addition， different concentrations of hydroxylamine were added to the nitrite system， and the effect of hydroxylamine on nitrite removal by strain EN-B2 was further explored. The results show when the concentration of hydroxylamine exceed 3 mg/L， as the concentration of hydroxylamine increase， the removal ability of EN-B2 decrease. This study is helpful for understanding the characteristics of Klebsiella Oxytoca EN-B2 in removing hydroxylamine and nitrite， which providing an important reference for the treatments of nitrogen contaminated wastewater.

Key words： Klebsiella oxytoca， hydroxyamine， nitrite， environmental factors