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    雷莫拉寧的分離純化工藝研究

    2012-07-28 05:47:14朱秀良王海燕李曉露張雪霞
    化學與生物工程 2012年8期

    朱秀良,王海燕,李 寧,林 毅,李曉露,張雪霞,蔣 沁

    (微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心,華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司,河北 石家莊 050015)

    雷莫拉寧(Ramoplanin,A-16686,MDL62)是一種新型的糖肽類抗生素,由意大利Cavalleri等[1]在游動放線菌(Actinoplanessp.)中首次分離得到,主要抑制革蘭氏陽性菌的生長,其純品是由A1、A2、A3、A1′、A2′、A3′、Ramoplanose等7個組分組成的混合物,其中A2為主要成分,占75%左右[2]。

    雷莫拉寧抑制細胞壁上肽聚糖的生物合成,其抑菌機制與萬古霉素及替考拉寧的抑菌機制不同;在體內(nèi)、體外的試驗中,雷莫拉寧均表現(xiàn)出良好的廣譜抗菌活性,大部分病原菌(革蘭氏陽性菌)對雷莫拉寧敏感性均高于萬古霉素和替考拉寧;雷莫拉寧的細胞毒性要比其它糖肽類抗生素小且無明顯不良反應及腎毒性[2]。因此,雷莫拉寧用于治療革蘭氏陽性菌引起的感染性疾病前景較好。

    目前,關(guān)于雷莫拉寧的分離純化研究較少,且已有的制備工藝繁瑣、成本高、所得產(chǎn)品純度低[3~5]。作者在此根據(jù)雷莫拉寧化學結(jié)構(gòu)中羥基多的特點,以聚酰胺樹脂為分離介質(zhì),從發(fā)酵液中分離純化雷莫拉寧,并對吸附及解吸條件進行了優(yōu)化,以期得到高純度雷莫拉寧。

    1 實驗

    1.1 材料、試劑與儀器

    雷莫拉寧發(fā)酵液,華藥集團新藥公司;雷莫拉寧標準品,自制;大孔樹脂LX-2000、LX-18,西安藍曉科技有限公司;大孔樹脂HZ801,上海華震科技有限公司;聚酰胺樹脂,上海滬峰生物科技有限公司;珍珠巖助濾劑,廊坊三新珍珠巖制品有限公司;去離子水,自制;乙腈(色譜純),美國Merck公司;工業(yè)乙醇,滄州興隆化工有限公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

    高效液相色譜儀(996檢測器,515泵),Waters公司;Loborata 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,Heidolph公司;TGL-16G型高速離心機,上海安亭科學儀器廠。

    1.2 HPLC檢測條件

    色譜柱:Agilent Eclipe XDB C8(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相:乙腈-酸水(0.1% H3PO4)(80∶20,體積比);流速:1.0 mL·min-1;檢測波長:254 nm;進樣量:10 μL。

    1.3 雷莫拉寧浸提液的制備

    在發(fā)酵液中加入5%~7%珍珠巖助濾劑,攪拌30 min,真空抽濾,用水洗滌得菌絲體;將菌絲體用適量80%乙醇-酸水(pH值3.0~3.5)攪拌下浸泡2 h,真空抽濾,得雷莫拉寧浸提液。

    1.4 樹脂的篩選

    根據(jù)雷莫拉寧弱極性及多羥基的特性,分別量取LX-2000、LX-18、HZ801和聚酰胺等4種弱極性吸附樹脂20 mL于4根適當?shù)牟Aе?,從柱頂注入雷莫拉寧浸提液至有目標產(chǎn)物從樹脂柱上流出時,停止上樣。以樹脂對雷莫拉寧的絕對吸附量為指標,并參照解吸收率進行篩選。

    1.5 吸附條件的考察

    1.5.1 雷莫拉寧浸提液濃度的選擇

    將雷莫拉寧浸提液用NaOH溶液調(diào)pH值為6.5~7.5,減壓濃縮除去乙醇,濃縮液過濾除去不溶物,再加去離子水稀釋成不同濃度(μg·mL-1):400、800、1200、1600、2000、2400、2800、3200,分別上聚酰胺樹脂柱(樹脂裝量20 mL,流速1.0 BV·h-1),HPLC在線檢測,當有目標產(chǎn)物流出時,停止上樣,計算吸附量,確定最佳雷莫拉寧浸提液濃度。

    1.5.2 吸附流速的選擇

    選擇流速(BV·h-1)分別為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0,每10 mL流出液為一個樣品,測其濃度,計算泄漏率,確定最佳吸附流速。

    1.6 解吸條件的考察

    取200 mL處理好的聚酰胺樹脂裝柱,將1000 mL 1600 μg·mL-1雷莫拉寧浸提液從柱頂注入,控制流速為1.0 BV·h-1。上樣完畢,依次采用體積分數(shù)為30%、50%、60%、70%、80%的乙醇解吸,解吸流速為0.5 BV·h-1。分段收集解吸液,HPLC在線檢測,計算不同體積分數(shù)乙醇的解吸收率,并結(jié)合解吸液質(zhì)量確定最佳解吸條件。

    1.7 結(jié)晶

    45 ℃下,將解吸液減壓濃縮至20 mg·mL-1左右,攪拌下緩緩加入8~10 BV丙酮,室溫靜置4 h,抽濾,丙酮洗滌,真空干燥,得到雷莫拉寧白色結(jié)晶粉末。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 樹脂的篩選(表1)

    表1 不同類型樹脂對雷莫拉寧的吸附量及解吸收率

    由表1可知,聚酰胺樹脂對雷莫拉寧的吸附量和解吸收率明顯大于其它樹脂,可以達到對雷莫拉寧的富集作用,而且聚酰胺樹脂的解吸液顏色較淺。故選用聚酰胺吸附樹脂進行后續(xù)實驗。

    2.2 吸附條件的優(yōu)化

    2.2.1 雷莫拉寧浸提液濃度對樹脂吸附量的影響(圖1)

    圖1 雷莫拉寧浸提液濃度對聚酰胺樹脂吸附量的影響

    由圖1可見,在相同的流速下,雷莫拉寧浸提液濃度越低,吸附量越高,但生產(chǎn)周期越長;雷莫拉寧浸提液濃度過高,又不利于樹脂吸附,吸附量較低。因此,選擇雷莫拉寧浸提液濃度為1600~2000 μg·mL-1。

    2.2.2 吸附流速對樹脂吸附量的影響(圖2)

    圖2 吸附流速對聚酰胺樹脂吸附量的影響

    由圖2可見,吸附流速大于1.0 BV·h-1后,泄漏率明顯升高;而吸附流速為0.5 BV·h-1與1.0 BV·h-1時的泄漏率相差不大。因此,選擇吸附流速為1.0 BV·h-1。

    2.3 解吸條件的優(yōu)化

    用不同體積分數(shù)的乙醇洗脫樹脂,結(jié)果見表2。

    表2不同體積分數(shù)乙醇的解吸收率

    Tab.2Desorptionyieldatdifferentvolumefractionsofethanol

    乙醇體積分數(shù)%解吸液體積/mL濃度/μg·mL-1純度/%解吸收率%306000-0506002715.00.360600111085.535.670600173392.660.28060040.279.71.2

    由表2可知,當乙醇體積分數(shù)小于50%時,洗脫的是一些色素和雜質(zhì);乙醇體積分數(shù)為60%時,洗脫不完全,解吸收率僅35.6%,這是由于乙醇體積分數(shù)低,樹脂孔徑未能充分溶脹,不利于雷莫拉寧在乙醇中的溶解;乙醇體積分數(shù)為70%時的解吸液濃度最高,且雜質(zhì)較少,純度也相對較高,說明70%乙醇有利于目標產(chǎn)物的洗脫;乙醇體積分數(shù)為80%時,解吸液濃度很低,純度也不高,解吸收率僅1.2%,說明目標產(chǎn)物已被洗脫完全。故,確定洗脫條件為:先用30%或50%乙醇洗去極性大的雜質(zhì),再用70%乙醇洗脫。

    將解吸液減壓濃縮至20 mg·mL-1左右,加入8~10 BV的丙酮,靜置4 h后,抽濾,用丙酮洗滌,真空干燥,得到純度大于95%的雷莫拉寧晶粉。

    2.4 工藝驗證

    在上述最佳分離純化工藝條件(以聚酰胺樹脂作為分離介質(zhì),雷莫拉寧浸提液濃度1600~2000 μg·mL-1,吸附流速1.0 BV·h-1,乙醇作洗脫劑)下,連續(xù)進行3批驗證實驗,結(jié)果見表3。

    表3 驗證實驗結(jié)果

    由表3可知,在最佳分離純化工藝條件下,總收率均超過80%、產(chǎn)品純度大于95%。

    3 結(jié)論

    采用聚酰胺吸附樹脂分離純化發(fā)酵液中的雷莫拉寧,在雷莫拉寧浸提液濃度為1600~2000 μg·mL-1、吸附流速為1.0 BV·h-1、乙醇作洗脫劑(先用30%或50%乙醇洗脫,再用70%乙醇洗脫)時,可得到高純度雷莫拉寧,總收率超過80%,純度大于95%。該方法簡單易行,收率穩(wěn)定,安全性高,適合工業(yè)化生產(chǎn)。

    參考文獻:

    [1] Cavalleri B,Pagani H,Volpe G,et al.A-16686,a new antibiotic fromActinoplanes.I.Fermention,isolation and preliminary physico-chemical characteristics[J].J Antibiot,1984,37(4):309-317.

    [2] 郭月玲,趙子弟,倪慧敏,等.新型糖肽類抗生素雷莫拉寧研究進展[J].河北化工,2011,34(8):28-31.

    [3] 李繼安,徐斌.一種雷莫拉寧的純化方法[P].CN 101 024 662,2007-08-29.

    [4] 李繼安,盧亮,張宏宇.雷莫拉寧的分離方法[P].CN 101 838 315A,2010-09-22.

    [5] 張春穎,周青.應用納濾濃縮純化技術(shù)從發(fā)酵液中制取雷莫拉寧[P].CN 102 010 462,2011-04-13.

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