雷莫拉寧的分離純化工藝研究

朱秀良，王海燕，李 寧，林 毅，李曉露，張雪霞，蔣 沁

(微生物藥物國(guó)家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心,華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司,河北 石家莊 050015)

雷莫拉寧(Ramoplanin，A-16686，MDL62)是一種新型的糖肽類(lèi)抗生素，由意大利Cavalleri等[1]在游動(dòng)放線菌(Actinoplanessp.)中首次分離得到，主要抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，其純品是由A1、A2、A3、A1′、A2′、A3′、Ramoplanose等7個(gè)組分組成的混合物，其中A2為主要成分，占75%左右[2]。

雷莫拉寧抑制細(xì)胞壁上肽聚糖的生物合成，其抑菌機(jī)制與萬(wàn)古霉素及替考拉寧的抑菌機(jī)制不同；在體內(nèi)、體外的試驗(yàn)中，雷莫拉寧均表現(xiàn)出良好的廣譜抗菌活性，大部分病原菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)對(duì)雷莫拉寧敏感性均高于萬(wàn)古霉素和替考拉寧；雷莫拉寧的細(xì)胞毒性要比其它糖肽類(lèi)抗生素小且無(wú)明顯不良反應(yīng)及腎毒性[2]。因此，雷莫拉寧用于治療革蘭氏陽(yáng)性菌引起的感染性疾病前景較好。

目前，關(guān)于雷莫拉寧的分離純化研究較少，且已有的制備工藝繁瑣、成本高、所得產(chǎn)品純度低[3～5]。作者在此根據(jù)雷莫拉寧化學(xué)結(jié)構(gòu)中羥基多的特點(diǎn)，以聚酰胺樹(shù)脂為分離介質(zhì)，從發(fā)酵液中分離純化雷莫拉寧，并對(duì)吸附及解吸條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期得到高純度雷莫拉寧。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

雷莫拉寧發(fā)酵液，華藥集團(tuán)新藥公司；雷莫拉寧標(biāo)準(zhǔn)品，自制；大孔樹(shù)脂LX-2000、LX-18，西安藍(lán)曉科技有限公司；大孔樹(shù)脂HZ801，上海華震科技有限公司；聚酰胺樹(shù)脂，上海滬峰生物科技有限公司；珍珠巖助濾劑，廊坊三新珍珠巖制品有限公司；去離子水，自制；乙腈(色譜純)，美國(guó)Merck公司；工業(yè)乙醇，滄州興隆化工有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

高效液相色譜儀(996檢測(cè)器，515泵)，Waters公司；Loborata 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，Heidolph公司；TGL-16G型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 HPLC檢測(cè)條件

色譜柱：Agilent Eclipe XDB C8(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-酸水(0.1% H3PO4)(80∶20，體積比)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 雷莫拉寧浸提液的制備

在發(fā)酵液中加入5%～7%珍珠巖助濾劑，攪拌30 min，真空抽濾，用水洗滌得菌絲體；將菌絲體用適量80%乙醇-酸水(pH值3.0～3.5)攪拌下浸泡2 h，真空抽濾，得雷莫拉寧浸提液。

1.4 樹(shù)脂的篩選

根據(jù)雷莫拉寧弱極性及多羥基的特性，分別量取LX-2000、LX-18、HZ801和聚酰胺等4種弱極性吸附樹(shù)脂20 mL于4根適當(dāng)?shù)牟Ａе校瑥闹斪⑷肜啄瓕幗嵋褐劣心繕?biāo)產(chǎn)物從樹(shù)脂柱上流出時(shí)，停止上樣。以樹(shù)脂對(duì)雷莫拉寧的絕對(duì)吸附量為指標(biāo)，并參照解吸收率進(jìn)行篩選。

1.5 吸附條件的考察

1.5.1 雷莫拉寧浸提液濃度的選擇

將雷莫拉寧浸提液用NaOH溶液調(diào)pH值為6.5～7.5，減壓濃縮除去乙醇，濃縮液過(guò)濾除去不溶物，再加去離子水稀釋成不同濃度(μg·mL-1)：400、800、1200、1600、2000、2400、2800、3200，分別上聚酰胺樹(shù)脂柱(樹(shù)脂裝量20 mL，流速1.0 BV·h-1)，HPLC在線檢測(cè)，當(dāng)有目標(biāo)產(chǎn)物流出時(shí)，停止上樣，計(jì)算吸附量，確定最佳雷莫拉寧浸提液濃度。

1.5.2 吸附流速的選擇

選擇流速(BV·h-1)分別為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0，每10 mL流出液為一個(gè)樣品，測(cè)其濃度，計(jì)算泄漏率，確定最佳吸附流速。

1.6 解吸條件的考察

取200 mL處理好的聚酰胺樹(shù)脂裝柱，將1000 mL 1600 μg·mL-1雷莫拉寧浸提液從柱頂注入，控制流速為1.0 BV·h-1。上樣完畢，依次采用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、60%、70%、80%的乙醇解吸，解吸流速為0.5 BV·h-1。分段收集解吸液，HPLC在線檢測(cè)，計(jì)算不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的解吸收率，并結(jié)合解吸液質(zhì)量確定最佳解吸條件。

1.7 結(jié)晶

45 ℃下，將解吸液減壓濃縮至20 mg·mL-1左右，攪拌下緩緩加入8～10 BV丙酮，室溫靜置4 h，抽濾，丙酮洗滌，真空干燥，得到雷莫拉寧白色結(jié)晶粉末。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹(shù)脂的篩選(表1)

表1 不同類(lèi)型樹(shù)脂對(duì)雷莫拉寧的吸附量及解吸收率

由表1可知，聚酰胺樹(shù)脂對(duì)雷莫拉寧的吸附量和解吸收率明顯大于其它樹(shù)脂，可以達(dá)到對(duì)雷莫拉寧的富集作用，而且聚酰胺樹(shù)脂的解吸液顏色較淺。故選用聚酰胺吸附樹(shù)脂進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 吸附條件的優(yōu)化

2.2.1 雷莫拉寧浸提液濃度對(duì)樹(shù)脂吸附量的影響(圖1)

圖1 雷莫拉寧浸提液濃度對(duì)聚酰胺樹(shù)脂吸附量的影響

由圖1可見(jiàn)，在相同的流速下，雷莫拉寧浸提液濃度越低，吸附量越高，但生產(chǎn)周期越長(zhǎng)；雷莫拉寧浸提液濃度過(guò)高，又不利于樹(shù)脂吸附，吸附量較低。因此，選擇雷莫拉寧浸提液濃度為1600～2000 μg·mL-1。

2.2.2 吸附流速對(duì)樹(shù)脂吸附量的影響(圖2)

圖2 吸附流速對(duì)聚酰胺樹(shù)脂吸附量的影響

由圖2可見(jiàn)，吸附流速大于1.0 BV·h-1后，泄漏率明顯升高；而吸附流速為0.5 BV·h-1與1.0 BV·h-1時(shí)的泄漏率相差不大。因此，選擇吸附流速為1.0 BV·h-1。

2.3 解吸條件的優(yōu)化

用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫樹(shù)脂，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的解吸收率

Tab.2Desorptionyieldatdifferentvolumefractionsofethanol

乙醇體積分?jǐn)?shù)%解吸液體積/mL濃度/μg·mL-1純度/%解吸收率%306000-0506002715.00.360600111085.535.670600173392.660.28060040.279.71.2

由表2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于50%時(shí)，洗脫的是一些色素和雜質(zhì)；乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，洗脫不完全，解吸收率僅35.6%，這是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)低，樹(shù)脂孔徑未能充分溶脹，不利于雷莫拉寧在乙醇中的溶解；乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)的解吸液濃度最高，且雜質(zhì)較少，純度也相對(duì)較高，說(shuō)明70%乙醇有利于目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫；乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，解吸液濃度很低，純度也不高，解吸收率僅1.2%，說(shuō)明目標(biāo)產(chǎn)物已被洗脫完全。故，確定洗脫條件為：先用30%或50%乙醇洗去極性大的雜質(zhì)，再用70%乙醇洗脫。

將解吸液減壓濃縮至20 mg·mL-1左右，加入8～10 BV的丙酮，靜置4 h后，抽濾，用丙酮洗滌，真空干燥，得到純度大于95%的雷莫拉寧晶粉。

2.4 工藝驗(yàn)證

在上述最佳分離純化工藝條件(以聚酰胺樹(shù)脂作為分離介質(zhì)，雷莫拉寧浸提液濃度1600～2000 μg·mL-1，吸附流速1.0 BV·h-1,乙醇作洗脫劑)下，連續(xù)進(jìn)行3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，在最佳分離純化工藝條件下，總收率均超過(guò)80%、產(chǎn)品純度大于95%。

3 結(jié)論

采用聚酰胺吸附樹(shù)脂分離純化發(fā)酵液中的雷莫拉寧，在雷莫拉寧浸提液濃度為1600～2000 μg·mL-1、吸附流速為1.0 BV·h-1、乙醇作洗脫劑(先用30%或50%乙醇洗脫，再用70%乙醇洗脫)時(shí)，可得到高純度雷莫拉寧，總收率超過(guò)80%，純度大于95%。該方法簡(jiǎn)單易行，收率穩(wěn)定，安全性高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Cavalleri B，Pagani H，Volpe G,et al.A-16686，a new antibiotic fromActinoplanes.I.Fermention，isolation and preliminary physico-chemical characteristics[J].J Antibiot，1984，37(4):309-317.

[2] 郭月玲,趙子弟,倪慧敏，等.新型糖肽類(lèi)抗生素雷莫拉寧研究進(jìn)展[J].河北化工,2011,34(8):28-31.

[3] 李繼安,徐斌.一種雷莫拉寧的純化方法[P].CN 101 024 662,2007-08-29.

[4] 李繼安,盧亮,張宏宇.雷莫拉寧的分離方法[P].CN 101 838 315A,2010-09-22.

[5] 張春穎,周青.應(yīng)用納濾濃縮純化技術(shù)從發(fā)酵液中制取雷莫拉寧[P].CN 102 010 462，2011-04-13.