兩株紅色糖多孢菌在不同氮源培養(yǎng)條件下的代謝比較

黃 剛，周 英，葉邦策

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)最初是由McGuire等人于1952年從土壤中分離得到的，是一種革蘭氏陽性放線菌，屬糖多孢菌屬[1]，與經(jīng)典的鏈霉菌(如阿維鏈霉菌和天藍(lán)色鏈霉菌)有較高的生物同源性。Markiyan Oliynyk在《Nature》上刊登了紅色糖多孢菌模式菌株NRRL23338的全基因組測序信息，為更加全面和系統(tǒng)地研究這一菌株奠定了基礎(chǔ)。紅色糖多孢菌因用于工業(yè)規(guī)模的紅霉素生產(chǎn)而受到廣泛關(guān)注和深入的研究。紅霉素(Erythromycin，Er)是一種含有十四元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[2]，具有廣泛的抗菌效能，包括多種成分，主要有紅霉素A(Er A)、紅霉素B、紅霉素C、紅霉素D等，其中紅霉素A是最早分離出來的，也是起主要病理作用的成分。

對于紅色糖多孢菌的研究，目前主要集中在對紅霉素生物合成相關(guān)分子機(jī)制的探索和紅霉素發(fā)酵工藝的改進(jìn)。其中紅霉素的合成模式已被作為聚酮類抗生素的合成典范得到了詳盡闡述，工業(yè)生產(chǎn)也達(dá)到了幾十噸甚至上百噸的規(guī)模。近年來，紅色糖多孢菌的研究有了新的發(fā)展和突破，如組學(xué)、代謝網(wǎng)絡(luò)分析對于抗生素合成代謝調(diào)控的闡述以及基于代謝流分析的多尺度優(yōu)化提高生產(chǎn)能力[3]等。盡管針對紅色糖多孢菌代謝網(wǎng)絡(luò)及紅霉素合成機(jī)制已經(jīng)做了大量研究工作[4]，但是由于微生物代謝的復(fù)雜性，紅霉素合成的全基因組水平上的調(diào)控機(jī)制仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有闡釋明確。而氮源代謝作為與抗生素合成緊密相關(guān)的代謝途徑，在鏈霉菌中也進(jìn)行了較多的闡述[5,6]。

轉(zhuǎn)錄組芯片和凝膠阻滯(EMSA)等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在紅霉素高產(chǎn)菌株中，與氮源代謝相關(guān)的基因(如glnR、glnB)、銨鹽與寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因等在高產(chǎn)菌株中被強(qiáng)烈抑制?？赏茰y在高產(chǎn)菌株和野生菌株中，氮源代謝存在很大差異，并與紅霉素合成存在緊密的聯(lián)系。作者在此進(jìn)一步對高產(chǎn)菌株和野生菌株在不同氮源條件下的代謝進(jìn)行比較，通過測定相應(yīng)胞內(nèi)氨基酸和有機(jī)酸的含量，探索氮源代謝與紅霉素合成的關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

RNeasy Mini RNA提取試劑盒，Qiagene公司；谷氨酸/谷氨酰胺ELISA測試試劑盒，上海銳聰生物科技有限公司；紅霉素、谷氨酸、谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；甲醇、乙腈，CNW公司；其它試劑均為國產(chǎn)化學(xué)純或者分析純。

LC-20AT型高效液相色譜儀，日本島津貿(mào)易公司；多功能酶標(biāo)儀，美國Biotech公司。

1.2 菌株

紅色糖多孢菌模式菌SaccharopolysporaerythraeaNRRL23338，記為M菌，德國菌株保藏中心；紅霉素高產(chǎn)菌，記為A菌，華東理工大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基為GYM培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖4.0，酵母提取物4.0，麥芽提取物10.0，pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基為SCM培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖30，酵母提取物6，蛋白胨4，甘氨酸2，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO40.68，pH值7.0，121 ℃滅菌25 min。

單一氮源培養(yǎng)基為在Evans培養(yǎng)基[7]中分別加入1%的蛋白胨、L-谷氨酰胺、硫酸銨、硝酸鈉。

1.4 方法

1.4.1 胞內(nèi)代謝物的提取[7]及測定

取發(fā)酵液20 mL，5000 r·min-1離心30 min，去上清，用等體積的60%乙醇重懸；放入液氮中凍融10 min，置于室溫溶解，反復(fù)凍融3次；用超聲波破碎儀超聲10 min(60次)，功率為300 W，工作時(shí)間3 s/間隙時(shí)間7 s；超聲完成后于5000 r·min-1離心30 min，取上清,經(jīng)冷凍、真空干燥、濃縮，即得胞內(nèi)代謝物。

色譜條件：Intersil ODS-4 C18反向色譜柱(4.0 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.027%濃硫酸(含0.0005 mol·L-1的十二烷基磺酸鈉)；pH值2.5；流速0.8 mL·min-1；柱溫30 ℃；紫外檢測波長210 nm。

1.4.2 谷氨酸和谷氨酰胺的測定

谷氨酸和谷氨酰胺的測定參照酶聯(lián)免疫(ELISA)測試試劑盒說明書進(jìn)行，顯色后用酶標(biāo)儀讀取吸光值。

1.4.3 紅霉素效價(jià)的測定

取1 mL發(fā)酵液，于12 000 r·min-1高速離心5 min，取上清，采用磷酸水解法測定紅霉素效價(jià)[8]：將上清用0.22 μm的微孔濾膜過濾處理，并將濾液用超純水稀釋到200 μg·mL-1；吸取稀釋的樣品0.8 mL于10 mL的容量瓶中，加入4 mL 10 mol·L-1的磷酸，搖勻；將容量瓶置于沸水中煮3 min，再冷至室溫，用10 mol·L-1的磷酸定容到10 mL，搖勻；以超純水作為空白對照，測定各處理后的樣品在485 nm處的吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基酸及有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1)

表1 氨基酸及有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同氮源條件下的氨基酸和有機(jī)酸的含量

不同氮源條件下，野生模式菌(M菌)和高產(chǎn)菌(A菌)在不同時(shí)間取樣，測定的氨基酸含量見圖1、有機(jī)酸含量見表2。

圖1 紅色糖多孢菌的谷氨酸與谷氨酰胺含量

表2 紅色糖多孢菌在不同時(shí)間的胞內(nèi)有機(jī)酸含量/μg·g-1

由圖1和表2可以看出，在4種不同氮源培養(yǎng)條件下，M菌與A菌體內(nèi)的氨基酸和有機(jī)酸含量存在顯著差異，同一菌株體內(nèi)的氨基酸和有機(jī)酸含量也存在顯著差異。

在同一菌株內(nèi)，與氮源代謝直接相關(guān)的α-酮戊二酸、谷氨酸、谷氨酰胺的含量和與碳源代謝相關(guān)的有機(jī)酸如蘋果酸、檸檬酸的含量在不同的氮源培養(yǎng)條件下呈現(xiàn)相反的趨勢。以18 h取樣為例，以硫酸銨作為唯一氮源時(shí)A菌體內(nèi)的α-酮戊二酸、谷氨酸、谷氨酰胺的胞內(nèi)含量達(dá)到最高，分別為8.81 μg·g-1、170 μg·g-1、140 pg·g-1，而蘋果酸和檸檬酸的含量則最低。

不同菌株間，以硫酸銨作為氮源時(shí)，A菌體內(nèi)的α-酮戊二酸、谷氨酸、谷氨酰胺含量較M菌顯著升高，蘋果酸和檸檬酸含量卻更低。這與芯片數(shù)據(jù)顯示的在工業(yè)菌株中銨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被強(qiáng)烈抑制的結(jié)果仿佛存在矛盾，但之前有報(bào)道在其它菌屬中，當(dāng)銨鹽濃度升高時(shí)，微生物會(huì)通過對體內(nèi)的谷氨酰胺合成酶(GS)進(jìn)行腺苷?；瘉硖岣咂浯呋芰9]，從而有效保持體內(nèi)谷氨酸與谷氨酰胺的含量。在次級代謝和初級代謝上，M菌初級代謝水平高于A菌，不利于抗生素等的合成。

硝酸鈉和蛋白胨對兩菌株的影響較為接近，A菌與M菌對這兩種氮源的利用都不會(huì)出現(xiàn)太多障礙，因?yàn)榈鞍纂吮旧碜鳛閺?fù)合型的氮源，為微生物的生長和代謝提供了多樣的營養(yǎng)選擇，在A菌體內(nèi)，由芯片數(shù)據(jù)可知硝酸鈉的轉(zhuǎn)運(yùn)得到了促進(jìn)，因此雖然是單一的氮源，但工業(yè)菌能有效對其進(jìn)行吸收和利用。而對于L-谷氨酰胺，由于其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在A菌體內(nèi)受到強(qiáng)烈抑制，因此與氮源代謝相關(guān)的α-酮戊二酸、谷氨酸、谷氨酰胺都明顯處于最低水平，也影響到了菌體的生長，檸檬酸循環(huán)中相應(yīng)的有機(jī)酸含量也較低。這些都與芯片數(shù)據(jù)所反映的情況一致。

對于紅霉素的合成，在硫酸銨、硝酸鈉和谷氨酰胺作為唯一氮源時(shí)，A菌的產(chǎn)量并不與野生菌存在差異，只有在復(fù)合氮源蛋白胨存在的情況下，紅霉素產(chǎn)量有較明顯的提高。這可能是因?yàn)椋瑔我坏床⒉蛔阋蚤L時(shí)間保證紅色糖多孢菌體內(nèi)碳氮源代謝的平衡，影響了菌體的生理狀態(tài)，pH值容易偏低，從而不利于紅霉素的合成。因此，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)可采取在基本培養(yǎng)基上添加過量的氮源并測定更多的代謝產(chǎn)物如紅霉素合成前體物質(zhì)等，更全面地考察紅霉素的產(chǎn)量與氮源添加的關(guān)系以及相關(guān)氮源代謝阻遏等機(jī)理。

2.3 討論

傳統(tǒng)的分子生物學(xué)手段在抗生素合成及相應(yīng)菌株的研究中遇到了瓶頸[10]，基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組等組學(xué)技術(shù)以全局性闡明鏈霉菌等體內(nèi)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的方式應(yīng)用越來越受到重視，但受限于微生物的復(fù)雜性和對龐大數(shù)據(jù)進(jìn)行有效挖掘，還需要對組學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行分子生物、發(fā)酵等實(shí)驗(yàn)的探索驗(yàn)證[11]。

本研究以實(shí)驗(yàn)室之前轉(zhuǎn)錄組基因芯片實(shí)驗(yàn)為指導(dǎo)，通過不同氮源添加實(shí)驗(yàn)，測定了在不同氮源條件下，紅色糖多孢菌野生菌和高產(chǎn)菌體內(nèi)與氮源代謝相關(guān)的氨基酸、有機(jī)酸的含量，展示了不同菌株內(nèi)的代謝情況。在銨鹽、谷氨酰胺過量時(shí)，高產(chǎn)菌株有效抑制了對其吸收，但體內(nèi)的谷氨酸、谷氨酰胺等處于高水平，可能是增強(qiáng)了谷氨酰胺合成酶(GS)等的催化活性的結(jié)果。并且在高產(chǎn)菌株中，與初級代謝相關(guān)的有機(jī)酸含量明顯低于野生菌株，這也說明高產(chǎn)菌株與野生菌株在代謝上的差異決定了抗生素的合成水平。測定結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果較為吻合，從而說明了芯片實(shí)驗(yàn)的可行性及可信度。這些工作還在進(jìn)一步展開和優(yōu)化過程中，但轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)后續(xù)的發(fā)酵和基因工程改造研究，將是系統(tǒng)研究菌株特性和抗生素合成的有效手段。

3 結(jié)論

通過測定4種單一氮源培養(yǎng)條件下的野生模式菌(M菌)和高產(chǎn)菌(A菌)體內(nèi)的有機(jī)酸和氨基酸含量來比較其代謝情況。結(jié)果表明，在同一菌株內(nèi)及不同菌株間，與氮源代謝直接相關(guān)的α-酮戊二酸、谷氨酸、谷氨酰胺的含量和與碳源代謝相關(guān)的有機(jī)酸如蘋果酸、檸檬酸的含量在不同的培養(yǎng)基內(nèi)呈現(xiàn)相反的趨勢。

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