地塞米松對(duì)慢性肺源性心臟病中心肌自身抗體的干預(yù)對(duì)比

喬可宏 楊清和 王 萍 王 虹

上世紀(jì)末在擴(kuò)張性心肌病中發(fā)現(xiàn)了抗M2受體的自身抗體的重要作用，后來(lái)在多種心臟疾病患者血清中都發(fā)現(xiàn)了心肌自身抗體，其中抗M2受體和β1受體的自身抗體研究最多，因而很多學(xué)者認(rèn)為，自身免疫在心肌損傷中扮演了一個(gè)很重要的角色［1］。那么作為以右心功能不全為主要表現(xiàn)的慢性肺源性心臟病(chronic cor pulmonale，CCP)的病因，單用缺氧導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓來(lái)解釋尚存很多質(zhì)疑，本研究的目的旨在探討自身免疫機(jī)制是否參與作用CCP的發(fā)生。

材料與方法

一、研究材料

1.研究對(duì)象:收集2010年1月至2010年12月，太原市中心醫(yī)院呼吸科及老年病科，年齡18～80歲的慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)急性加重期組患者。CCP組包括急性加重期組和臨床緩解期組患者;正常對(duì)照組，為太原市中心醫(yī)院體檢中心體檢正常者。自2010年1月至2010年10月每組收集符合條件的以上病例數(shù)均達(dá)20例。

2.實(shí)驗(yàn)材料

(1)試劑:地塞米松片(山西同達(dá)藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H14023304);生物素化羊抗人IgG單克隆抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司提供);辣根酶標(biāo)記鏈親和素(北京中山生物技術(shù)有限公司提供);底物2，2’-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)(上海生工生物工程公司進(jìn)口分裝);抗原肽段由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司參照相關(guān)序列合成，受體抗原肽段(按照以下序列合成):

①M(fèi)2膽堿能受體細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段序列169-193位氨基酸殘基

V-R-T-V-E-D-G-E-C-Y-I-Q-F-F-S-N-A-A-V-T-F-G-T-A-I-C

②M3膽堿能受體細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段序列18-36位氨基酸殘基

S-S-W-I-H-S-P-S-D-A-G-L-P-P-G-T-V-T-H

③AT1血管緊張素II受體細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段序列165-191位氨基酸殘基

I-H-R-N-V-F-F-I-E-N-T-N-I-T-V-C-A-F-H-Y-E-S-Q-N-S-T-L

④α1腎上腺素能受體細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段序列192-218位氨基酸殘基

G-W-K-E-P-V-P-P-D-E-R-F-C-G-I-T-E-E-A-G-Y-A-V-V-F-S-S

⑤β1膽堿能受體細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段序列197-222位氨基酸殘基

H-W-W-R-A-E-S-D-E-A-R-R-C-Y-N-D-P-K-C-C-D-F-V-T-N-R

⑥β2膽堿能受體細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段序列172-197位氨基酸殘基

H-W-Y-R-A-T-H-Q-E-A-I-N-C-Y-A-N-E-T-C-C-D-F-F-T-N-Q-C

⑦β3膽堿能受體細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段序列176-202位氨基酸殘基

Q-W-W-R-V-G-A-D-A-E-A-Q-R-C-H-S-N-P-R-C-C-A-F-A-S-N-M-P-V)。

(2)儀器:DG3022型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Molecular Devices Corp，Menio Park，CAUSA)

(3)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所:太原市中心醫(yī)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室

二、研究方法

1.分組標(biāo)準(zhǔn)

(1)COPD組(20例):參照衛(wèi)生部統(tǒng)編第七版內(nèi)科學(xué)教材中診斷標(biāo)準(zhǔn)。

(2)CCP組:收集患者主要為確診COPD10年以上，病程遷延發(fā)展，明確診斷為CCP者。其中分為急性加重期組(20例)和臨床緩解期組(20例)，參照衛(wèi)生部統(tǒng)編第七版內(nèi)科學(xué)教材中診斷標(biāo)準(zhǔn)。

(3)正常對(duì)照組(20例):我院體檢中心體檢正常者(體檢項(xiàng)目包括:常規(guī)生命體征，血壓、血糖、血脂、肝腎功能、血常規(guī)、尿常規(guī)、便常規(guī)、胸片、心電圖、腹部彩超，均在正常范圍)。

(4)入組過(guò)程中排除外左心系統(tǒng)疾病，如冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、風(fēng)濕性心臟病、支氣管擴(kuò)張、間質(zhì)性肺疾病、支氣管哮喘、肺血管疾病、結(jié)締組織病及其他可能影響心功能、肺通氣及換氣功能、免疫因素的疾病。

2.采血及血清的提取:于受試者明確診斷后1～2 d及口服地塞米松片10 mg干預(yù)治療后提取清晨空腹肘靜脈血，經(jīng)2000 r/min離心10 min后提取血清，每管20 μl分裝，－80℃保存。

3.入組后治療及剔除標(biāo)準(zhǔn):入組患者的住院及門(mén)診治療均采用呼吸科常規(guī)治療方法，包括:抗生素、支氣管擴(kuò)張劑、化痰、吸入糖皮質(zhì)激素、改善心功能及對(duì)癥支持治療。

剔除標(biāo)準(zhǔn):(1)試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)生其他影響心肺功能及免疫系統(tǒng)的疾病，例如:急性心肌梗死、肺栓塞等(本次試驗(yàn)剔除5例);(2)試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)診斷錯(cuò)誤(本次試驗(yàn)剔除1例);(3)患者中途退出(本次試驗(yàn)剔除10例);(4)患者試驗(yàn)過(guò)程中死亡(本次試驗(yàn)剔除3例);(5)試驗(yàn)過(guò)程中靜脈使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等干擾試驗(yàn)數(shù)據(jù)的因素(本次試驗(yàn)剔除6例)。

4.指標(biāo)檢測(cè):采用SA-ELISA方法進(jìn)行心肌自身抗體的測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行心電圖、超聲心動(dòng)圖(右室流出道內(nèi)徑、右室內(nèi)徑及左右室內(nèi)徑比值)、血?dú)夥治?動(dòng)脈血氧分壓、動(dòng)脈血二氧化碳分壓)檢查。

5.數(shù)據(jù)分析:①抗體定性判定:以(標(biāo)本光密度值-空白光密度值)/(陰性光密度值-空白光密度值)，即P/N值≥2.1為陽(yáng)性，P/N值≤1.5為陰性。②抗體效價(jià)判定:將血清標(biāo)本從1︰20起連續(xù)倍比稀釋?zhuān)猿霈F(xiàn)P/N值≥2.1的最高稀釋度作為該標(biāo)本的效價(jià)。

6.免疫干預(yù):采用小劑量激素地塞米松10 mg/d，口服，共2周，作為免疫抑制劑干預(yù)治療，再次采血并復(fù)查各項(xiàng)指標(biāo)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

1.各干預(yù)前后自身抗體陽(yáng)性率的變化比較(分別以 M2、M3、AT1、α1、β1、β2、β3表示血清中 M2、M3、AT1、α1、β1、β2、β3相應(yīng)自身抗體的陽(yáng)性率):參照前文受體抗體陽(yáng)性率計(jì)算方法，通過(guò)對(duì)各組干預(yù)治療后數(shù)據(jù)分析可見(jiàn)，COPD急性加重期組、正常對(duì)照組干預(yù)前后數(shù)據(jù)無(wú)明顯差異，肺心病急性加重期組中M3、AT1、α1、β1均有明顯差異，臨床緩解期組干預(yù)前后僅β1有明顯差異，但總體CCP急性加重期組、臨床緩解期組在干預(yù)后數(shù)值均有下降的趨勢(shì)，見(jiàn)表1。

2.超聲心動(dòng)圖(右室流出道內(nèi)徑、右室內(nèi)徑及左右室內(nèi)徑比值)結(jié)果比較:通過(guò)超聲心電圖比較可見(jiàn)COPD急性加重期組和正常對(duì)照組干預(yù)前后無(wú)明顯差異，但CCP組干預(yù)后右室流出道內(nèi)徑、右室內(nèi)徑及左右室內(nèi)徑比值明顯減少，見(jiàn)表2。

3.血?dú)夥治?動(dòng)脈血氧分壓以PaO2表示、動(dòng)脈血二氧化碳分壓以PaCO2表示)結(jié)果比較:通過(guò)血?dú)夥治鲋笜?biāo)測(cè)定可見(jiàn)，干預(yù)前后COPD急性加重期組和CCP組經(jīng)過(guò)干預(yù)治療后，動(dòng)脈血氧分壓明顯升高、動(dòng)脈血二氧化碳分壓明顯下降，考慮干預(yù)治療能有效改善血?dú)夥治鲋笜?biāo)，見(jiàn)表3。

表1 干預(yù)前后自身抗體陽(yáng)性率的變化比較Table 1 Comparison of positive rate of antoantibody before and after intervention

表2 干預(yù)前后超聲心動(dòng)圖結(jié)果比較Table 2 Comparison of ultrasonic cardiogram before and after intervention

表3 干預(yù)前后血?dú)夥治鼋Y(jié)果比較Table 3 Comparison of blood gas analysis before and after intervention

討 論

長(zhǎng)期以來(lái)CCP的研究主要集中在缺氧導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓這一主要機(jī)制上，但近年眾多研究提示，CCP的發(fā)病中免疫因素同樣起著重要作用［1-2］。許多心臟疾病患者血清中都發(fā)現(xiàn)多種抗心肌自身抗體，已證實(shí)這些抗心肌自身抗體在心臟可以與其受體結(jié)合產(chǎn)生類(lèi)激動(dòng)劑樣作用，并且脫敏時(shí)間延長(zhǎng)，它的持續(xù)存在造成心肌損害［3-5］。臨床中對(duì)嚴(yán)重?cái)U(kuò)心病患者采用免疫吸附去除自身抗體或采用免疫抑制劑治療后，也可使患者病情改善［1］。因此它們與心肌的結(jié)構(gòu)和功能改變可能有關(guān)，但是其中眾多抗體作用相拮抗，它們對(duì)心臟是否起到損害作用尚不清楚，我們就此入手，對(duì)多種心肌自身抗體進(jìn)行研究。

心肌中存在多組相拮抗的受體，之間相互平衡而發(fā)揮作用，研究顯示在心臟發(fā)揮作用的主要受體如下:①腎上腺素受體分為α、β兩種，α中α1少量存在于心臟組織，主要引起血管平滑肌的收縮，β1-受體在心臟產(chǎn)生正性變時(shí)、變力、變傳導(dǎo)作用，導(dǎo)致腎素分泌增加致血壓升高;而β3-受體主要存在于脂肪組織，心臟含量甚微，高濃度方可激動(dòng)，但有研究顯示，對(duì)β1-受體、β2-受體均抑制之后，仍有激動(dòng)作用，而產(chǎn)生負(fù)性變時(shí)，變力，變傳導(dǎo)，考慮為心臟的保護(hù)性受體［7］;②乙酰膽堿受體中對(duì)心臟有影響的主要為M2和M3受體，M2受體在心臟，主要起負(fù)性變時(shí)，變力，變傳導(dǎo)作用，但有研究顯示可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，而M3受體，主要存在于血管、平滑肌、腺體等，導(dǎo)致血管平滑肌舒張;③而血管緊張素Ⅱ受體分為AT1和AT2受體，其中AT1主要存在于心臟的竇房結(jié)和傳導(dǎo)束，起主導(dǎo)作用，促進(jìn)心肌、平滑肌收縮，導(dǎo)致血管平滑肌和心肌肥厚，而AT2受體胚胎中含量高，出生后濃度銳減，考慮為保護(hù)性抗體。

本研究顯示在COPD、CCP的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，心肌自身抗體水平逐步升高，其中AT1組、β1組增高明顯，β3組、M3組增高較低，可能隨著CCP的發(fā)生發(fā)展，心肌自身抗體水平逐漸增高，在阻塞性肺氣腫組已有增高趨勢(shì)，并在CCP組達(dá)最高峰。我們認(rèn)為在CCP的發(fā)生、發(fā)展中，心肌自身抗體水平升高，其中可能存在持續(xù)正性作用，即正性變時(shí)、變力、變傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致心肌肥厚。雖然存在心肌的保護(hù)性抗體，如β3受體抗體，但結(jié)合本研究，導(dǎo)致心肌損害的自身抗體無(wú)論從數(shù)量上還是濃度上均占主導(dǎo)作用。我們認(rèn)為在心肌自身抗體對(duì)心臟的損害作用中，α1、β1、β2、M3、AT1受體抗體均可導(dǎo)致心肌受體的持續(xù)激動(dòng)作用，脫敏延遲，心肌肥厚，導(dǎo)致或加劇心肌損害、心衰產(chǎn)生;從而超過(guò)了β3、M2受體抗體的保護(hù)性與上述拮抗作用。

而地塞米松作為臨床常用的免疫抑制劑，小劑量使用有抑制免疫的作用，干預(yù)后發(fā)現(xiàn)自身抗體水平下降，臨床指標(biāo)好轉(zhuǎn)，考慮在免疫抑制時(shí)，損害心肌的抗體被抑制，而保護(hù)性抗體同樣被抑制，但后者數(shù)量小，作用相對(duì)弱，總體效果表現(xiàn)為臨床指標(biāo)的好轉(zhuǎn)。對(duì)于以上抗體的研究可以對(duì)CCP的診斷治療提供依據(jù)，探索某種抗體是否可以作為CCP的疾病嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)指標(biāo)，而干預(yù)治療中是否應(yīng)趨利避害，則應(yīng)分別對(duì)待，本研究目前尚處于實(shí)驗(yàn)室階段，尚有待進(jìn)一步臨床研究證實(shí)。

通過(guò)我們的研究考慮:①COPD、CCP的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，心肌自身抗體水平逐步升高，其中AT1組、β1組增高明顯，β3組、M3組增高較低，但隨著CCP的發(fā)生發(fā)展，心肌自身抗體水平逐漸增高;②通過(guò)小劑量激素地塞米松抑制自身免疫反應(yīng)后，抗體水平有不同程度的下降，CCP急性加重期組中M3、AT1、α1、β1均有明顯差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，臨床心臟彩超、血?dú)夥治鲋笜?biāo)改善，臨床觀察患者癥狀明顯改善，考慮為抑制免疫反應(yīng)后，患者癥狀及臨床指標(biāo)改善，抗體水平下降。

1 喬可宏，劉學(xué)軍.大鼠缺氧致肺心病模型和M2受體主動(dòng)免疫模型心肌結(jié)構(gòu)的比較研究［J］.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2010，29(7):605-608.

2 喬人立.重新認(rèn)識(shí)慢性阻塞性肺疾病與肺源性心臟?。跩］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2011，34(4):246-248.

3 Stavrakis S，Kem DC，Patterson E，et al.Opposing cardiac effects of autoantibody activation of beta-adrenergic and M2 muscarinic receptors in cardiac-related diseases［J］.Int J Cardiol，2010，1(1):5.

4 Yu X，Patterson E，Stavrakis S，et al.Development of cardiomyopathy and atrial tachyarrhythmias associated with activating autoantibodies to beta-adrenergic and muscarinic receptors［J］.J Am Soc Hypertens，2009，3(2):133-140.

5 Jahns R，Boivin V，Hein L，et al.Direct evidence for β1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy［J］.J Clin Invest，2004，113(10):1419-1429.

6 陳 瑾，胡大一，張 麟，等.卡維地洛對(duì)心臟β-1、β-2和α-1受體自身抗體及心功能的影響［J］.中華心血管病雜志，2005，33(6):498-501.

7 Freedman NJ，Lefkowitz RJ.Anti-β1-adrenergic receptor antibodies and heart failure:causation，not just correlation［J］.Clin Invest，2004，113(10):1379-1382.

8 Nussinovitch U，Shoenfeld Y.The clinical and diagnostic significance of anti-myosin autoantibodies in cardiac disease［J］.Clin Rev Allergy Immunol，2011，1(5):8299.

9 Niu X，Watts VL，Cingolani OH，et al.Cardioprotective effect of Beta-3 adrenergic receptor agonism:role of neuronal nitric oxide synthase［J］.J Am Coll Cardiol，2012，29(6):1979-1987.

10 馬秀瑞，王敬萍，劉慧榮.抗β_3腎上腺素能受體自身抗體對(duì)心衰大鼠心臟的保護(hù)作用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2010，(10):105-107.

11 Pan Z，Guo Y，Qi H，et al.M3 subtype of muscarinic acetylcholine receptor promotes cardioprotection via the suppression of miR-376b-5p［J］.PLoS One，2012，7(3):e32571.

12 Kruse AC，Hu J，Pan AC，et al.Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor［J］.Nature，2012，2(22):552-556.