不同循環(huán)冷凍消融術對西藏小型豬肺部冷凍消融效果的比較

姚 飛 曾健瀅 陳繼冰 周 亮 吳炳輝 方 剛 鄧春娟 陳志賢 冷 尹 鄧 敏 張 波 鄧春梅 李家亮 何麗華 牛立志 左建生 徐克成

冷凍消融治療因具有冰球可視化，對大血管損傷輕微，手術創(chuàng)傷小，可激活免疫等許多優(yōu)點而被應用于腫瘤臨床治療［1-4］。但對于冷凍治療來說，在不同組織中因局部微環(huán)境，如血流、組織的絕緣性能，電阻以及空氣流量存在差異，導致消融程序和消融效果存在差異［5］。由于肺組織的肺泡中存在大量空氣流，在一個冷凍循環(huán)結束后，肺局部區(qū)域內熱導率可增加20倍(空氣:0.024 W/mK，水:0.58 W/mK，血液:0.49～0.5 W/mK)，因此當肺部采用冷凍消融治療時，冷凍-復溫程序往往會對最終的消融效果產(chǎn)生重大影響［6］。2010年，Hinshaw等［7］及牛立志等［8］通過對豬肺的冷凍研究顯示，在術中可觀察到三循環(huán)冷凍-復溫程序較兩循環(huán)冷凍-復溫程序產(chǎn)生更大的冰球及損傷區(qū)域。但上述研究直至目前還沒有術后長期病理變化的證據(jù)。為此，本研究以西藏小型豬為研究模型，分別用兩重和三重冷凍-復溫循環(huán)程序對其肺部實施冷凍消融，旨在評價即時的冷凍損傷及術后7 d的組織病理損傷變化，期望能為肺部腫瘤冷凍找到一個合適的消融程序。

材料與方法

一、實驗動物

西藏小型豬5頭，體質量27～32 kg，普通級，動物生產(chǎn)許可證號為［SCXC(粵)200620015］，動物合格證號為［粵監(jiān)證字0087238］，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供。常規(guī)喂養(yǎng)，實驗前2周內接受常規(guī)檢查，無飲食和行為異常。本研究獲得復大醫(yī)院倫理委員會的批準。

二、氬氦冷凍系統(tǒng)

冷凍設備采用氬氦冷凍系統(tǒng)(EndorcareTM，CA，USA)，該系統(tǒng)是根據(jù)焦耳定律設計，其原理是高壓氣體經(jīng)過狹窄的噴嘴進入探針尖端，壓力突然下降，不同的氣體在局部產(chǎn)生不同的溫度變化。氬氣引起溫度降低(可達－150℃)，氦氣可使溫度升高(可達60℃)。

三、實驗方法

將西藏小型豬捆綁固定，右側臥位，對術區(qū)進行消毒、備皮等。用速眠3 ml誘導麻醉，然后給予1.5% ～2%濃度異氟醚維持全身麻醉，氧流量保持在1.5 L/min。開胸腔暴露肺臟，選擇豬右肺上葉1點和下葉2點作為靶點，兩靶點距離為5 cm，兩支2.0 mm冷凍探針分別插入右肺上葉和下葉各靶點。①兩循環(huán)冷凍組:以100%的氬氣激活探針，使針尖溫度達(－140±5)℃持續(xù)10 min，改輸氦氣復溫至(25±5)℃，持續(xù)5 min，為第1個循環(huán)，重復上述冷凍-復溫循環(huán)，共行2個循環(huán);②三循環(huán)冷凍組:類似于兩循環(huán)冷凍組，不同點是3個循環(huán)冷凍組冷凍-復溫循環(huán)為:先行2次冷凍5 min、復溫5 min的循環(huán)，第3循環(huán)為冷凍10 min、復溫5 min。術中對豬進行心肺監(jiān)護。冷凍完畢后拔針，用明膠海綿止血。術后肌注速尿20 mg、地塞米松5 mg和青霉素160 IU。游標卡尺測量并記錄冰球表面最大直徑，記錄冷凍探針溫度變化。

四、病理觀察

所有實驗豬于術后7 d分別靜脈給予戊巴比妥注射液100 mg/kg處死(此處置方法獲得復大醫(yī)院倫理委員會批準)。沿針道解剖實驗豬肺組織，取冷凍損傷區(qū)組織，10%福爾馬林溶液固定，作常規(guī)病理切片，蘇木精-伊紅溶液染色后，在光鏡下觀察組織學改變。

五、統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以Graphpad Prism 5(GraphPad)軟件進行分析。實驗數(shù)值均使用Mean±SD描述，用配對樣本t檢驗對計量資料進行分析，以P＜0.05為差異統(tǒng)計學意義，P＜0.01和P＜0.001為統(tǒng)計學有顯著性差異。

結 果

一、不同冷凍組形成冰球大小差異

冷凍時肺部表面形成以探針為中心的界限清楚的白色圓形冰球區(qū)域(圖1A)，冰球邊緣有充血現(xiàn)象，冰球周圍組織形態(tài)顏色無異常。每次循環(huán)結束測量兩個冷凍組形成冰球表面最大長徑，兩循環(huán)冷凍組:1.7±0.5 cm 和2.46 ±0.06 cm。三循環(huán)冷凍組:1.5 ±0.4 cm，2.1 ±0.1 cm 和 3.1 ±0.1 cm(圖1A)。冷凍結束后，三循環(huán)冷凍組冷凍形成冰球大于兩循環(huán)形成冰球(P=0.011)。兩個冷凍程序肺部冷凍中心點溫度都在1 min內降至－120℃以下，復溫過程達到25～35℃。

二、術后冷凍區(qū)域表面和內部損傷變化

7 d后處死動物，解剖觀察，冷凍中心區(qū)肉眼可見近圓形紅褐色病灶，呈骨髓樣，質地糜爛;病灶周邊可見暗紅色水腫圈，觸摸質地柔軟，與外周組織分界較明顯(圖1B、C)。其他區(qū)域組織眼觀無異常。兩循環(huán)冷凍組與三循環(huán)冷凍組表面損傷區(qū)最大長徑分別達到:3.87±0.64 cm和3.95±0.81 cm(圖1B)。兩組冷凍損傷區(qū)冷凍中心點距離為5cm，而冷凍形成冰球較大，內部損傷區(qū)存在重疊區(qū)。沿兩冷凍中心點中間垂直切開，可見一橢圓形損傷區(qū)域。游標卡尺分別測量兩循環(huán)冷凍組與三循環(huán)冷凍組冷凍損傷區(qū)深度為:3.57±0.4 cm和3.8±0.44 cm(圖1C、D)。7 d后兩循環(huán)冷凍組與三循環(huán)冷凍組冷凍引起損傷區(qū)表面最大長徑和損傷深度差異不顯著。

圖1 肺部冷凍表面與內部損傷

三、冷凍損傷區(qū)病理變化

病理檢查結果顯示兩循環(huán)冷凍組與三循環(huán)冷凍組存在相同的病理分區(qū)(圖2):①中心壞死區(qū)，可見較多壞死組織，呈紅色;②炎癥區(qū)，可見中性粒細胞和淋巴細胞浸潤;③肉芽腫區(qū)，可見大量纖維細胞和毛細血管增生，還有少量中性粒細胞;④充血區(qū)，該區(qū)域內有肺泡縱膈增寬，大量紅細胞滲出，細胞壞死;⑤凋亡區(qū)，正常肺泡組織，肺泡間隔清晰，可見纖維增生、淋巴細胞侵潤及凋亡細胞。上述病例分區(qū)1～4，構成冷凍損傷的完全壞死區(qū)，凋亡區(qū)仍可見正常組織及細胞。兩循環(huán)冷凍與三循環(huán)冷凍組冷凍引起的完全壞死區(qū)域分別為:1.84 ±0.6 cm 和 2.46 ±0.5 cm，二者差異有統(tǒng)計學意義(圖 3，P=0.031)。而兩循環(huán)冷凍組引起的細胞凋亡區(qū)域更大，但三循環(huán)組所引起壞死區(qū)域更大。

圖3 冷凍消融效果比較

討 論

近年來，肺部冷凍相關研究已取得一定進展。Izumi等［9］以豬為動物模型，證實豬肺部冷凍手術的可行性，并指出兩循環(huán)冷凍比單循環(huán)冷凍更能延長出血時間和降低肺部泄漏的空氣。Littrup等［10］建立人肝、肺冷凍程序，即冷凍采用雙循環(huán)，冷凍10 min，復溫5 min，該冷凍程序現(xiàn)已被廣大外科醫(yī)生接受。Gage等［2］報道冷凍周期的設計取決于多種因素，包括凍結和解凍的持續(xù)時間、解凍率、組織溫度、周期數(shù)和周期間隔等。Hinshaw等［7］將10-5-10-5 min冷凍-復溫修正為3-3-7-7-5-5 min冷凍-復溫，并在對這兩種不同冷凍程序進行比較時發(fā)現(xiàn)，在相同的冷凍-復溫時間內，肺部三循環(huán)冷凍較兩循環(huán)冷凍存在如下優(yōu)勢:影像下可更早形成消融區(qū);更短冷凍時間和更大消融區(qū)域。本試驗發(fā)現(xiàn)，豬肺部三循環(huán)冷凍組形成冰球長徑較大，7 d后三循環(huán)冷凍組引起的病理上完全壞死區(qū)達到24.6 mm，也顯著大于兩循環(huán)冷凍組所引起18.4 mm完全壞死區(qū)(圖3)。在相同的冷凍時間內三循環(huán)冷凍肺部消融效果更好。提示更為復雜的消融程序會造成更強細胞壞死效應。

Whittaker等［11］指出，受解凍時間的影響，第二冷凍周期后細胞內形成較大規(guī)模冰晶。本研究顯示冷凍過程中實際形成冰球直徑大于冰球表面直徑，冷凍形成的冰球區(qū)大于冷凍造成真實損傷區(qū)，因此在判斷肺癌冷凍效果時不能簡單只依靠冰球大小來判斷，而應依據(jù)觀察冷凍組織病理變化來做判斷。在CT或B超監(jiān)控下，冰球的形成呈現(xiàn)可視化，但細胞壞死往往距離冰球前沿還有5～10 mm距離，因此術中在影像學下監(jiān)控冰球的大小臨床意義有限［12］。病理學在評價消融效果時更為直觀、準確，且在冷凍后不同時間點均可進行評估。本研究顯示三循環(huán)組比兩循環(huán)組將冷凍壞死等溫線向外推6.4 mm，兩循環(huán)組引起的壞死區(qū)域距離冷凍損傷區(qū)邊緣約為2 mm，而三循環(huán)組引起的壞死區(qū)超出了壞死區(qū)邊沿約4 mm。這表明三循環(huán)冷凍-復溫程序與兩循環(huán)冷凍-復溫程序產(chǎn)生的冷凍損傷區(qū)域相似，但三循環(huán)產(chǎn)生的完全壞死區(qū)域更大。在臨床上，準確地監(jiān)控完全壞死區(qū)具有重要的意義，特別當消融靶區(qū)域比鄰敏感組織，如食管、喉返神經(jīng)和肺中央氣管等。本次實驗還發(fā)現(xiàn)，兩組冷凍損傷區(qū)均可見大量壞死組織、中性粒細胞和淋巴細胞浸潤及充血現(xiàn)象，而在損傷區(qū)邊緣可見纖維增生、淋巴細胞侵潤及凋亡細胞，但三循環(huán)冷凍組與兩循環(huán)冷凍組相比，所引起組織壞死范圍更廣，凋亡區(qū)域較小。Sabel等［13-15］報道冷凍促使機體免疫激活，炎性細胞浸潤會促使機體發(fā)生二次細胞凋亡，部分凋亡細胞因冷凍造成局部缺氧而最終壞死，但也有部分活性細胞會在巨噬細胞的修復機制幫助下通過caspase-3途徑恢復。因此在冷凍消融治療腫瘤過程中，在相同條件下減小凋亡區(qū)，增大壞死區(qū)將會達到更好的消融效果。

綜上表明，在肺部三循環(huán)冷凍-復溫程序較兩循環(huán)復溫-冷凍程序更易引起類似冷凍損傷，但三循環(huán)冷凍-復溫程序會引起更為廣泛的組織壞死。三循環(huán)冷凍-復溫程序更適合肺部腫瘤冷凍消融治療。

1 周紅桃，牛立志，周 亮，等.冷消融聯(lián)合放射性碘粒子植入治療不可切除的肺癌［J］.中國肺癌雜志，2008，11(6):780-783.

2 Gage AA，Baust JM，Baust JG.Experimental cryosurgery investigations in vivo［J］.Cryobiology，2009，59(3):229-243.

3 張彩霞，程 穎，馬麗霞，等.氬氦刀治療晚期非小細胞肺癌免疫增強作用的研究［J］.腫瘤，2007，9(27):741-743.

4 徐克成，牛立志.腫瘤冷凍治療學［M］.上海:上海科技教育出版社，2007:9-99.

5 Gage AA，Baust J.Mechanisms of tissue injury in cryosurgery［J］.Cryobiology，1998，37(3):171-186.

6 Yu TH，Liu J，Zhou YX.Selective freezing of target biological tissues after injection of solutions with specific thermal properties［J］.Cryobiology，2005，50(2):174-182.

7 Hinshaw JL，Littrup PJ，Durick N，et al.Optimizing the protocol for pulmonary cryoablation:a comparison of a dual-and triple-freeze protocol［J］.Cardiovasc Intervent Radiol，2010，33(6):1180-1185.

8 牛立志，王靜，邱大衛(wèi)，等.經(jīng)皮冷凍豬肺的影像學和病理學研究［J］.中國肺癌雜志，2010，13(7):676-680.

9 Izumi Y，Oyama T，Ikeda E，et al.The acute effects of transthoracic cryoablation on normal lung evaluated in a porcine model［J］.Ann Thorac Surg，2005，79(1):318-322.

10 Littrup PJ，Jallad B，Vorugu V，et al.Lethal isotherms of cryoablation in a phantom study:effects of heat load，probe size，and number［J］.J Vasc Interv Radiol，2009，20(10):1343-1351.

11 Whittaker DK.Repeat freeze cycles in cryosurgery of oral tissues［J］.Br Dent J，1975，139(12):459-465.

12 Littrup PJ，Ahmed A，Aoun HD，et al.CT-guided percutaneous cryotherapy of renal masses［J］.J Vasc Interv Radiol，2007，18(3):383-392.

13 Sabel MS.Cryo-immunology:a review of the literature and proposed mechanisms for stimulatory versus suppressive immune responses［J］.Cryobiology，2009，58(1):1-11.

14 Gazzaniga S，Bravo A，Goldszmid SR，et al.Inflammatory changes after cryosurgery-induced necrosis in human melanoma xenografted in nude mice［J］.J Invest Dermatol，2001，116(5):664-671.

15 Schacht V，Becker K，Szeimies RM，et al.Apoptosis and leucocyte-endothelium interactions contribute to the delayed effects of cryotherapy on tumours in vivo［J］.Arch Dermatol Res，2002，294(8):341-348.