無梗五加莖中3種酚酸類成分的HPLC-DAD-MS分析

金敏婷， 蘇 瑞， 許 鑫， 張舒婷， 方洪壯

(佳木斯大學藥學院，黑龍江佳木斯154007)

無梗五加Acanthopananx sessiliflorus(Rupr.Et Maxim.)Seem.為五加科五加屬植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有健肝強腎、益氣、活骨疏筋等功效。無梗五加中的酚酸類成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用［1-5］。無梗五加的研究報道，多為黃酮、香豆素、多糖、皂苷類等活性成分的提取分離、分析及藥理作用［6-10］，而關于酚酸類成分的定量測定鮮見報道。本研究通過HPLC-DAD-MS聯(lián)用技術對無梗五加莖中化學物質(zhì)進行定性分析，并結(jié)合文獻相應的質(zhì)譜［11］，確定了原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸3種酚酸成分。采用HPLC多波長法同時測定3種酚酸成分，并對12個不同產(chǎn)地無梗五加莖中3種有效成分進行比較。所建立的定量方法簡便、快速、準確可靠、應用性強。

1 儀器與材料

Agilent 1200型高效液相色譜/Agilent 6310質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括:四元泵，自動脫氣機，自動進樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器，6310型電噴霧質(zhì)譜儀，Agilent色譜工作站。原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸標準品，純度≥99.5%(天津一方科技有限公司)，乙腈、甲醇為色譜純(天津市科密歐化學試劑有限公司)，磷酸、醋酸均為分析純。12批樣品，分別于2009年采自黑龍江、遼寧不同的縣市區(qū)，經(jīng)佳木斯大學宗希明高級實驗師鑒定為無梗五加莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C8柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);柱溫為50 ℃;體積流量為1 mL/min;進樣量為10 μL。定性分析與定量分析的流動相，分別為乙腈-甲醇-0.2%甲酸水溶液及乙腈-甲醇-0.4%磷酸水溶液，洗脫方式相同，流動相梯度洗脫見表1。定性分析色譜檢測波長為270 nm，數(shù)據(jù)波長記錄范圍為200～400 nm。定量測定檢測波長為260 nm和324 nm。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 The gradient elution program

2.2 質(zhì)譜條件 ESI電離源，負離子模式掃描，離子阱質(zhì)量分析器，干燥氣(N2)體積流量為10.0 L/min，干燥氣溫度為350℃，霧化器壓力為35.0 psi，質(zhì)量掃描范圍:50～1000 m/z。

2.3 混合對照品溶液制備 取原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸對照品適量，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸混合對照品貯備液，原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸質(zhì)量濃度分別為 2.0、5.0、6.0 mg/mL。

2.4 供試品溶液制備 取無梗五加莖(粉碎過50目篩)粉末約5.0 g，精密稱定，置具塞圓底燒瓶中，精密加入50 mL甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，水浴90℃下回流提取2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足失質(zhì)量，搖勻，濾過，濃縮提取液。用甲醇轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶，并稀釋至刻度，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng) 0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.5 定性分析 在上述檢測條件下，供試液在HPLC上經(jīng)流動相乙腈-甲醇-0.2%甲酸水梯度洗脫分離，分別得到270 nm波長下的色譜圖與一級質(zhì)譜掃描總離子流圖(見圖1)。從圖1可知，無梗五加溶液在保留時間25 min前，有3個較強的譜峰。分別提取3個譜峰的DAD所記錄的光譜圖(見圖2)及MS-MS數(shù)據(jù)的一級、二級質(zhì)譜圖(見圖3～5)。綜合分析3種成分的光譜與其準分子離子峰及其碎片離子，經(jīng)與對照品在相同檢測條件下的色譜保留時間、光譜及質(zhì)譜信息比對，并結(jié)合文獻的數(shù)據(jù)與圖譜［11］，確定3種成分分別為原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸。

圖1 供試液270 nm色譜圖(A)和總離子流圖(B)Fig.1 LC chromatograms(A)in 270 nm and total ion current chromatogram(B)of sample

圖2 無梗五加中3種成分UV光譜圖Fig.2 UV spectra of three compounds in sample

圖3 化合物1的一級(A)、二級(B)質(zhì)譜圖Fig.3 MS，MS/MS spectra of compound 1

圖4 化合物2的一級(A)、二級(B)質(zhì)譜圖Fig.4 MS，MS/MS spectra of compound 2

2.6 定量分析

圖5 化合物3的一級(A)、二級(B)質(zhì)譜圖Fig.5 MS，MS/MS spectra of compound 3

2.6.1 色譜系統(tǒng)適用性 取供試液溶液，按設定的定量色譜條件進樣測定，得到樣品260 nm和324 nm下的色譜圖(見圖6)。原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸的保留時間分別為 10.23、19.17 和 21.36 min;3種物質(zhì)理論塔板數(shù)分別為20945，69196，63817。原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，分離度符合定量要求。

圖6 樣品的260 nm和324 nm HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of sample at 260 nm and 324 nm

2.6.2 線性關系 分別精密量取混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL 置于 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。取混合對照品溶液及其稀釋液，按照2.1項下色譜條件測定3種成分的峰面積。以對照品質(zhì)量濃度X(mg/mL)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，分別繪制原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸的標準曲線，并進行回歸運算，結(jié)果表明，3種成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關系良好。各成分的回歸方程、線性范圍及相關系數(shù)見表2。

表2 線性關系Tab.2 Linear relationship

2.6.3 精密度試驗 取混合對照品溶液4.0 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。在上述的色譜條件下重復進樣5次，測定色譜的峰面積，計算原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸色譜峰面積的RSD分別為 0.82%，0.64%，0.75%，表明儀器的精密度良好。

2.6.4 重復性試驗 取同產(chǎn)地的樣品6份，按2.4項下方法制備供試品溶液，并按照2.1項下色譜條件進行分析，測定原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸色譜峰面積的 RSD 分別為1.7%，0.34%，1.3%，實驗方法重復性良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗 制備供試品溶液，室溫下放置，按照2.1 項下色譜條件分別于 0、2、4、8、12、24 h測定，計算原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸峰面積的RSD 分別為1.7%，0.45%，1.4%，表明供試液在 24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.6 回收率試驗 取已知含有量同產(chǎn)地樣品9份，各約2.5 g，精密稱定，每3份為1組。每組分別精密加入一定量的原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸對照品溶液，按2.4項下方法制備低、中、高3個水平供試品溶液。按2.1項下色譜條件進行分析測定，計算原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸的回收率，結(jié)果見表3。

表3 回收率結(jié)果(n=9)Tab.3 Results of recovery(n=9)

2.7 樣品的測定 分別取12個不同產(chǎn)地的無梗五加莖粗粉各約5.0 g，精密稱定，按2.4項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，采用外標法計算樣品中原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸，不同產(chǎn)地無梗五加莖中3種成分質(zhì)量分數(shù)，見表4。

3 討論

3.1 化學成分確定 在HPLC上，混合對照品溶液中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸與樣品中的目標峰呈現(xiàn)相同的色譜保留時間;樣品中3個目標峰的DAD檢測表明，它們各自的紫外光譜與混合對照品中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸的光譜一致;在質(zhì)譜負離子模式下，目標峰與混合對照品中相應物持的準分子離子、主要碎片離子的質(zhì)荷比相同。樣品中3個目標峰對應的物質(zhì)被確定為原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸。

表4 樣品測定結(jié)果Tab.4 The contents of 3 compound in samples from different areas

3.2 檢測波長選擇 由3種待測成分的DAD下的光譜圖(圖3)可知，原兒茶酸最大吸收波長分別是260 nm和295 nm，綠原酸、咖啡酸在295 nm和324 nm均有兩個吸收峰。295 nm對于3種成分雖有較強吸收，但其強度不及260 nm、324 nm，故選擇260 nm為原兒茶酸檢測波長，324 nm為綠原酸及咖啡酸檢測波長。

3.3 色譜柱選擇 考察了相同規(guī)格(250 mm×4.6 mm，5 μm)的 3種不同的 Agilent Zorbax色譜柱(XDB-C18、SB-C18、SB-C8)，由于實驗中所涉及的流動相酸性較強，舍棄了XDB-C18柱;另由于樣品中極性成分較多，待測成分在SB-C18色譜柱未能有效地分離，而所涉及的3種成分在SB-C8柱上，分離效果良好、與鄰峰的分離度均大于1.5，故最終選定Agilent Zorbax SB-C8柱。

3.4 流動相及柱溫選擇 比較了0.2%和0.4%磷酸溶液-乙腈-甲醇梯度洗脫體系，在使用0.2%磷酸溶液時，3種成分的色譜峰有部分拖尾現(xiàn)象，增加酸度后，峰形得到改善。在室溫及30℃、40℃柱溫條件下，3種成分的色譜分離不理想，升高柱溫至50℃后，分離效果達到了定量要求。

由于磷酸水溶液不能揮發(fā)，易污染檢測器，不宜用作液質(zhì)分析流動相，故樣品在進行質(zhì)譜定性分析時，流動相中的酸水溶液的酸采用易揮發(fā)的甲酸。

3.5 3種成分質(zhì)量分數(shù)比較 12個不同產(chǎn)地的無梗五加莖中綠原酸的量明顯高于原兒茶酸和咖啡酸。同一成分因產(chǎn)地的不同，質(zhì)量分數(shù)有較大的差別。遼寧產(chǎn)地原兒茶酸較黑龍江產(chǎn)地量大，其中以丹東(LN-1)的量為最大，而綠原酸與咖啡酸在黑龍江產(chǎn)地量較高，其中蘿北(HLJ-6)產(chǎn)地量最多。

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