徐丁潔, 成秀梅, 杜惠蘭*, 徐 洪
(1.河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合婦科教研室,河北石家莊050091;2.河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合外科教研室,河北石家莊050091;3.河北醫(yī)科大學(xué)病理科,河北唐山063000)
寒證為八綱之一,婦科寒證是臨床較為多見的病證之一。我們?cè)鴮?duì)1122名婦女進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),屬月經(jīng)病寒證者411人,占36.63%[1]。寒客沖任、胞宮,影響女性正常經(jīng)孕。正常月經(jīng)一方面依賴于下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)功能正常,促使卵泡發(fā)育成熟,分泌雌、孕激素。另一方面,雌、孕激素須與子宮內(nèi)膜組織中的相應(yīng)受體結(jié)合,才能發(fā)揮其生理作用[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究加減溫經(jīng)湯對(duì)寒凝血瘀模型大鼠卵巢激素雌二醇(Estradiol,E2)和孕酮(Progesterone,P)水平及子宮內(nèi)膜雌激素受體(Estrogen Receptor,ER)、孕激素受體(Progesterone Receptor,PR)表達(dá)的影響,探討其治療寒凝血瘀型婦科疾病的作用機(jī)理。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠,雌性,鼠齡3個(gè)月,體質(zhì)量(190±10)g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(冀)2008-1-003,合格證號(hào)1006025。
1.2 試劑 加減溫經(jīng)湯:當(dāng)歸10 g、川芎10 g、白芍10 g、肉桂10 g、莪術(shù) 10 g、丹皮 10 g、吳茱萸 10 g、懷牛膝 12 g、甘草6 g,一次性購(gòu)于石家莊樂仁堂藥業(yè)。首先將當(dāng)歸、川芎、莪術(shù)、肉桂、吳茱萸5種藥物浸泡,然后加入8倍量的水,用蒸餾法提取揮發(fā)油,密閉保存。取藥渣與浸泡的其他藥物一起水煎3次,30 min/次,過(guò)濾,共得藥液 1200 mL,離心、濃縮至含生藥3.52 g/mL。將藥液置4℃冰箱備用,用時(shí)取出,與揮發(fā)油混合,用蒸餾水稀釋至所用濃度。
E2(批號(hào)RG60905)、P(批號(hào)RG50905)放免試劑盒購(gòu)自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。
一抗:ERα(SC-542)、PR(SC-538)(兔抗大鼠)工作液購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology。二抗:SP-9001兔 SP kit,購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。濃縮型DAB試劑盒,ZLI-9032,購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
1.3 造模方法及分組 大鼠30只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常組、模型組、治療組,每組10只。正常組常規(guī)飼養(yǎng),另兩組大鼠置于0~1℃冰水中20 min,1次/d,連續(xù)2周[3]。治療組于造模的第1天開始,每日分別按29.32 g/kg(相當(dāng)于臨床成人劑量的20倍)給予加減溫經(jīng)湯灌胃,連續(xù)2周。
1.4 陰道上皮細(xì)胞檢查 每日上午、下午各做陰道涂片一次,處死前2 d,每隔2 h涂片一次以確定動(dòng)情周期,以0.5%的堿性美藍(lán)溶液染色10 min,自來(lái)水輕輕洗去多余的染色液,待干,用普通光學(xué)顯微鏡觀察。
1.5 取材方法 擇動(dòng)情期間斷頭取血,制備血清,放射免疫分析法檢測(cè)E2、P。取子宮,吸去血跡,置于4%多聚甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋,4 μm厚連續(xù)切片,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,觀察子宮內(nèi)膜ER、PR的表達(dá)。
1.6 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟到水。滴加0.1%的胰酶,37℃烤箱中孵育10 min。PBS沖洗,3 min×3次。3%H202去離子水室溫孵育10 min。PBS沖洗,3 min×3次。10%正常山羊血清封閉非特異性抗原,37℃烤箱中孵育10 min,傾去,勿洗。滴加1∶200稀釋的一抗,4℃過(guò)夜。PBS沖洗,3 min×3次。滴加生物素標(biāo)記的二抗IgG,37℃烤箱中孵育10 min。PBS沖洗,3 min×3次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37℃烤箱中孵育10 min。PBS沖洗,3 min×3次。室溫下DAB顯色2~5 min。自來(lái)水終止顯色,蘇木復(fù)染,返藍(lán),脫水,透明,封片。
切片均在同一條件下按SP法進(jìn)行免疫組化染色。用已知的陽(yáng)性切片同時(shí)在同一條件下染色作為陽(yáng)性對(duì)照,用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。
1.7 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 每個(gè)組織隨機(jī)選取1張切片進(jìn)行分析,應(yīng)用Image pro plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行圖像采集和分析。于每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野,各采集1張200倍的圖像,計(jì)算積分光密度(integral optical density,IOD)值,6張圖像的IOD平均值作為該片指標(biāo)的代表值。平均光度值越高,表達(dá)越強(qiáng)。
2.1 動(dòng)物一般狀況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,正常組和治療組大鼠外觀無(wú)明顯差異,毛色白而光澤,精神狀況佳,活潑,反應(yīng)靈敏;模型組大鼠精神不振,毛色不榮,尾涼,少動(dòng)、大部分出現(xiàn)腹瀉。
2.2 動(dòng)情周期的變化 根據(jù)陰道上皮脫落細(xì)胞[4]判斷大鼠動(dòng)情周期,分為動(dòng)情前期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期。比較各組大鼠處死前最后一個(gè)動(dòng)情周期各階段時(shí)間的變化。
與正常組比較,模型組大鼠動(dòng)情周期及動(dòng)情間期延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),與模型組比較,治療組大鼠動(dòng)情周期及動(dòng)情間期縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),并且恢復(fù)至正常水平(均P>0.05)。動(dòng)情前期及動(dòng)情后期各組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。
表1 各組之間動(dòng)情周期比較(±s)
表1 各組之間動(dòng)情周期比較(±s)
注:與正常組比較,*P <0.05;與模型組比較,#P <0.05。
/d正常組組別 動(dòng)物數(shù)/只動(dòng)情周期/d動(dòng)情間期/d動(dòng)情前期/d動(dòng)情后期10 4.1 ±0.4 1.4 ±0.3 1.5 ±0.4 1.7 ±0.5模型組 10 5.0 ±0.9* 2.1 ±0.5* 1.8 ±0.7 1.9 ±0.7治療后 10 4.3 ±0.7# 1.7 ±0.4#1.7 ±0.5 1.9 ±0.6
2.3 血清E2、P值變化 與正常組比較,模型組血清 E2、P值降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);與模型組比較,治療組血清E2、P值升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),并且均恢復(fù)至正常水平(均P>0.05)。(見表2)
表2 各組之間血清E2、P值比較(±s)
注:與正常組比較,*P <0.05,**P <0.01;與模型組比較,#P <0.05。
組別 動(dòng)物數(shù)/只 E2/(pg·mL-1) P/(ng·mL-1)正常組10 41.32 ±15.02 4.87 ±0.79模型組 10 26.03 ±10.90* 3.62 ±0.61**治療組 10 38.64 ±13.73# 4.51 ±0.71#
2.4 子宮內(nèi)膜ER、PR平均光密度值變化 與正常組比較,模型組子宮內(nèi)膜ER、PR表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01);與模型組比較,治療組子宮內(nèi)膜ER、PR表達(dá)增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),ER表達(dá)恢復(fù)至正常水平(P >0.05)。(見表3)
表3 各組之間子宮內(nèi)膜ER、PR平均光密度值比較(±s)
表3 各組之間子宮內(nèi)膜ER、PR平均光密度值比較(±s)
注:與正常組比較,*P <0.05,**P <0.01;與模型組比較,#P <0.05。
ER PR正常組組別 動(dòng)物數(shù)/只10 253.86 ±26.72 207.84 ±23.66模型組 10 211.03 ±23.11** 163.22 ±18.78**治療組 10 236.81 ±24.43# 185.91 ±20.01*#
“婦人以血為本”,寒為陰邪,性主收引、凝滯,極易與血搏結(jié)。寒客沖任、胞宮,可使經(jīng)脈拘攣,血行瘀滯,“不通則痛”,發(fā)為痛經(jīng);或沖任、胞脈被阻,胞宮不能按時(shí)滿盈,而導(dǎo)致月經(jīng)后期月經(jīng)過(guò)少、閉經(jīng)、不孕癥等。根據(jù)“寒者熱之”、“結(jié)者散之”的治則,我們擬定溫經(jīng)散寒、活血化瘀調(diào)經(jīng)之加減溫經(jīng)湯。前期臨床及實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)本方可通過(guò)改善生殖內(nèi)分泌激素、調(diào)節(jié)致痛及鎮(zhèn)痛物質(zhì),改善卵巢功能,治療寒凝血瘀型婦科疾病[5-8]。本實(shí)驗(yàn)從子宮內(nèi)膜受體方面進(jìn)一步完善其作用機(jī)制。
正常婦女的月經(jīng)周期中,子宮內(nèi)膜ER、PR呈周期性變化,在增殖期雌激素促進(jìn)子宮內(nèi)膜 ER、PR的合成,ER、PR含量逐漸增加,于增殖末期達(dá)高峰。在分泌期,由于孕激素抑制子宮內(nèi)膜ER、PR的合成,子宮內(nèi)膜ER、PR含量均下降[2]。子宮內(nèi)膜ER、PR的異常表達(dá)將影響E2和P值對(duì)內(nèi)膜的發(fā)育、合成和分泌功能,影響子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)[9-10]。女性激素水平及子宮內(nèi)膜組織中相應(yīng)受體含量任一方面減低或功能異常,都可使子宮內(nèi)膜發(fā)生形態(tài)或功能的改變,繼而影響婦女正常的經(jīng)孕過(guò)程[11-13]。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,寒凝血瘀模型組大鼠外觀及精神均欠佳。陰道細(xì)胞雖呈周期性變化,但表現(xiàn)為動(dòng)情周期延長(zhǎng),主要是動(dòng)情間期延長(zhǎng)。模型組大鼠血清E2、P值較正常組明顯下降,子宮內(nèi)膜ER、PR表達(dá)亦降低;經(jīng)加減溫經(jīng)湯治療后,血清E2、P值水平升高,子宮內(nèi)膜ER、PR表達(dá)增強(qiáng),且血清E2、P值及子宮內(nèi)膜ER表達(dá)恢復(fù)至正常水平。表明加減溫經(jīng)湯可調(diào)節(jié)卵巢激素水平,增強(qiáng)子宮內(nèi)膜ER、PR的表達(dá),修復(fù)寒邪對(duì)子宮內(nèi)膜的損傷,調(diào)節(jié)HPOA,使其達(dá)到一種平衡狀態(tài),綜合作用下達(dá)到治療寒凝血瘀型婦科疾病的目的。本實(shí)驗(yàn)卵巢激素水平、子宮內(nèi)膜受體表達(dá)從兩方面,揭示了寒凝血瘀型婦科疾病發(fā)生的生物學(xué)機(jī)制,完善了加減溫經(jīng)湯治療寒凝血瘀型婦科疾病的機(jī)理。
[1]杜惠蘭,柴麗娜.月經(jīng)病寒凝血瘀證的病理機(jī)制初探[J].中醫(yī)雜志,1993,34(7):4295-5429.
[2]牛恩美,蔡根生,唐振華,等.116例正常月經(jīng)周期婦女子宮內(nèi)膜胞漿雌、孕激素受體含量的研究[J].生殖與避孕,1984,4(2):33.
[3]成秀梅,杜惠蘭,李 丹.寒凝血瘀動(dòng)物模型的創(chuàng)建[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2005,11(8):604-605.
[4]王月鵬,趙行宇,張慧鋒.成年大鼠性周期陰道細(xì)胞變化探究[J].中國(guó)科技信息,2007(17):192-193.
[5]杜惠蘭,李清雪,魏影非,等.加減溫經(jīng)湯對(duì)月經(jīng)病實(shí)寒證患者生殖激素及5-HT、β-EP 的影響[J].中成藥,2005,27(9):1047-1050.
[6]蘇 健,杜惠蘭.月經(jīng)病寒凝血瘀證與ET、NO的關(guān)系及加減溫經(jīng)湯對(duì)其影響[J].中成藥,2007,29(11):1571-1574.
[7]成秀梅,杜惠蘭,李 丹.加減溫經(jīng)湯對(duì)寒凝血瘀模型大鼠卵巢功能的影響[J].中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2006,29(2):118-121.
[8]成秀梅,杜惠蘭,李 丹.溫經(jīng)湯對(duì)寒凝血瘀模型大鼠卵巢血紅素氧合酶表達(dá)的影響[J].中醫(yī)雜志,2011,52(2):141-143.
[9]秦 曲.雌激素受體家族在生殖器官中的表達(dá)與功能[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)計(jì)劃生育分冊(cè),2001,209(2):87-89.
[10]陸金春.孕激素受體的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)計(jì)劃生育分冊(cè),1996,15(4):218-221.
[11]Goroderki I G,Geier A,Siegal A,et al.Decreased ratio of total progesterone to total estradiol receptor levels in endometria of women with adult dysfunctional uterine bleeding[J].Gynecol Obstet Invest,1986,22(1):22.
[12]夏 陽(yáng),張吉金,哈孝廉.益腎軟堅(jiān)法對(duì)子宮內(nèi)膜囊腺型增生性功血患者子宮內(nèi)膜雌、孕激素受體及超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中醫(yī)雜志,2000,41(8):476-479.
[13]田曉暉,楊樹君.細(xì)胞因子與子宮異常出血的關(guān)系研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2011,51(6):113.