高效液相色譜法同時測定苯妥英鈉和卡馬西平的血藥濃度

蘇煌財，林玉仙，張宏

福州市第一醫(yī)院臨床藥學(xué)科 福建 福州 350009

苯妥英鈉(phenytoin sodium，DPH)、卡馬西平(carbamazepine，CBZ)是臨床常用的一線抗癲癇藥物。苯妥英鈉臨床常用于癲癇大發(fā)作治療，卡馬西平是癲癇單純和復(fù)雜部分性發(fā)作的首選藥物。苯妥英鈉、卡馬西平在藥物動力學(xué)方面存在較大個體差異，卡馬西平治療窗口狹窄，治療量與中毒量很接近，因此臨床上需要進行監(jiān)測用藥[1,2]。苯妥英鈉和卡馬西平臨床經(jīng)常有聯(lián)合用藥情況，建立高效液相色譜法同時測定人血清中苯妥英鈉(DPH) 、卡馬西平(CBZ)的藥物濃度是很有必要的，已有文獻報道[3,4]。本研究采用簡便、快速、靈敏、重現(xiàn)性好的高效液相色譜法來同時測定苯妥英鈉和卡馬西平的血藥濃度。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 標準品：苯妥英鈉(批號200401，中國藥品生物制品檢定所)、卡馬西平(批號9503，中國藥品生物制品檢定所)；內(nèi)標：苯乙酮(德國進口)。流動相：甲醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司) 為色譜純；鹽酸(分析純)；二重蒸餾水。

1.2 儀器 Waters高效液相色譜儀，包括515型溶劑泵，7725i手動進樣器，Waters 2487雙波長紫外檢測器，Empower軟件。TG-328電光分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；1612-3型臺式高速離心機(上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠)；XW-80A漩渦混合器(上海醫(yī)大儀器廠)；PHS-3C型精密酸度計(上海大普儀器有限公司)。

2 測定前處理

2.1 色譜條件 以Symmetryshield RP18(5.0μm ,3.9×150mm)色譜柱，甲醇:水(50:50)為流動相；使用前經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾。流速：1.0mL·min-1,柱溫：25℃，進樣量：20μL，檢測波長：210nm，靈敏度：0.5AUFS。

2.2 標準品配置 精密稱取苯妥英鈉1.2mg、卡馬西平1.0mg，分別置于25mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得苯妥英鈉(濃度為44mg·L-1)、卡馬西平(濃度為40mg·L-1)儲備液，將以上兩種儲備液定量稀釋成一系列苯妥英鈉、卡馬西平標準儲備液。苯乙酮4℃密度為1.028，取5mL定容至25mL，再取100μL定容至50mL即得到41.12mg·L-1。

2.3 樣品處理 精密量取血漿0.1mL，精密加入內(nèi)標20μL及0.1M鹽酸15μL，精密加入甲醇200μL，漩渦混勻3min，10000r·min-1[1]離心4min，取上清液20μL，進樣分析。

2.4 方法專屬性 按上述色譜條件和血漿處理方法檢測，色譜圖如圖1。各種藥物保留時間分別為tR內(nèi)=3.818min、tRcbz=5.170min、tRpt=5.986min，峰形較好，血漿中雜質(zhì)不干擾測定。

3 方法與結(jié)果

3.1 標準曲線的繪制 精密量取苯妥英鈉、卡馬西平標準品儲備液，分別加入空白血漿相應(yīng)毫升數(shù)，配成一系列濃度苯妥英鈉(2.2，4.4，8.8，11.0，17.6，22.0，33.0 mg·L-1)、卡馬西平(2.0，4.0，8.0，10.0，20.0，30.0 mg·L-1)溶液。按本實驗相應(yīng)的方法項進行處理，并進行HPLC檢測，采用內(nèi)標法進行線性回歸，測得回歸方程：卡馬西平Y(jié)=1.60e+005X-6.14e+004(r=0.9998)；苯妥英鈉Y=9.40e+004X-1.28e+005(r=0.9994)。

3.2 提取回收率的測定 精密量取苯妥英鈉、卡馬西平標準品儲備液，加入甲醇配制成高、中、低3個不同濃度即苯妥英鈉33.0、17.6、2.2mg·L-1，卡馬西平30.0、10.0、2.0mg·L-1。取20μL進樣，記錄峰面積為A1；另取空白血漿0.1mL，加入高、中、低相應(yīng)濃度的苯妥英鈉、卡馬西平標準品儲備液，按2.3項下操作，記錄樣品的峰面積A2，以A2/A1之值計算提取回收率。見表1。

表1 提取回收率試驗結(jié)果(n=5)Tab1 Results of recovery test(n=5)

表2 苯妥英鈉和卡馬西平的日內(nèi)和日間精密度(n=3)Tab2 Within day and between day precision of Phenytoin,Carbamazepine (n=3)

結(jié)果表明，高、中、低3個濃度的2種標準品的提取回收率均大于90%，RSD＜2%，滿足生物樣品測定的要求。

3.3 精密度考察 精密量取苯妥英鈉、卡馬西平標準品儲備液，加入空白血漿配制成高、中、低3種不同濃度的樣品液各6份，在不同天內(nèi)連續(xù)制備并測定3個分析批，計算苯妥英鈉和卡馬西平的日內(nèi)和日間精密度。見表2。各值均小于2%，滿足生物樣品測定的要求。

3.4 干擾性試驗 根據(jù)我院的特點，在上述色譜條件下，進行地西泮、氯硝西泮、撲米酮、氨茶堿、環(huán)孢素A等多種藥物的測試，均不干擾苯妥英鈉、卡馬西平、苯乙酮的測定。

4 討論

本實驗建立的HPLC法在靈敏度、重現(xiàn)性、專一性、線性范圍、回收率等多方面都有明顯的優(yōu)勢。在測定波長的選擇上，經(jīng)紫外掃描后苯妥英、卡馬西平在210nm 處吸收最強且線性關(guān)系較好，故選擇210nm 為測定波長，這與相應(yīng)的文獻報道相吻合；本實驗的樣品預(yù)處理簡單，采用沉淀法操作簡單、重現(xiàn)性好，且儀器的靈敏度能夠達到測定要求。考慮到用甲醇沉淀血漿的上層清液pH為8.5～9.5[5]，人體血清含Cl-的濃度為96～108mmol·L-1[6]，所以可以用0.1mol·L-1鹽酸15μL，將沉淀液pH降至7.2左右，起到保護色譜柱的作用；流動相采用甲醇與水體積比50:50，這一組無干擾內(nèi)標、苯妥英、卡馬西平主峰，且分離都達到相應(yīng)要求。無須在流動相中加入有毒或腐蝕性的成分，可延長色譜柱的壽命。

[1]陳 剛.治療藥物監(jiān)測[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,1988:385.

[2]沈鼎烈.癲癇治療的現(xiàn)狀[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2001,27(1):1.

[3]馮惠平,吳佳濱,李碧峰等.反相高效液相色譜法同時測定苯妥英鈉、卡馬西平的血藥濃度[J].中國藥業(yè),2008,17(7):54-55.

[4]李朋梅,張相林,唐崑等.高效液相色譜法同時測定苯巴比妥、卡馬西平及苯妥英鈉的血藥濃度[J].中日友好醫(yī)院學(xué)報,2007,21(5):312-315.

[5]劉文英.藥物分析[M].第五版,北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:88.

[6]張建國.診斷學(xué)[M].第四版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1990:463.