肝硬化大鼠小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)改變與內(nèi)毒素血癥

趙生環(huán)，范 紅，宋正己，湯 敏

昆明醫(yī)學(xué)院附屬昆華醫(yī)院·云南省第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，云南昆明650032

內(nèi)毒素血癥在肝硬化的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中具有重要的病理生理意義。其發(fā)生機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，尚未完全明了，國內(nèi)外均有研究表明，肝硬化時小腸黏膜屏障功能受損及腸道通透性可明顯增高，導(dǎo)致腸道內(nèi)革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素容易進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，引起腸源性內(nèi)毒素血癥，本研究觀察由硫代乙酰胺(TAA)誘導(dǎo)的和膽管結(jié)扎術(shù)(BDL)后膽汁淤積引起的肝硬化大鼠小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變和內(nèi)毒素水平的增高來闡明兩者之間的密切相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 硫代乙酰胺(TAA)、內(nèi)毒素鱟試劑盒(廈門市鱟試劑實驗廠有限公司)、光鏡、電鏡、分光光度計。

1.2 肝硬化大鼠模型制作 實驗動物隨機(jī)分為3組:正常對照組、模型組每組12只。正常對照組:腹腔內(nèi)注射注射用水0.5 mL，每周兩次(周一、周四)，共8周;模型組(TAA組):腹腔內(nèi)注射10%TAA 200 mg/kg(首次劑250 mg/kg)，每周2次(周一、周四)，共8周;模型組(BDL組):自由飲水和飲食1周后，行膽總管結(jié)扎術(shù)，8周成模;大鼠造模死亡率為52.7%，最后成模共17只，TAA組10只，BDL組7只。

1.3 腸壁組織光鏡觀察 取十二指腸下空腸，生理鹽水沖洗后在50%甲醛液中固定，石蠟包埋，切片后用常規(guī)蘇木精伊紅染色，切片光鏡下觀察。

1.4 腸壁組織電子顯微鏡觀察 取十二指腸下空腸，生理鹽水沖洗后，以2.5%的戊二醛固定，經(jīng)脫水、包埋，超薄切片后于透射電鏡下觀察小腸黏膜超微結(jié)構(gòu)改變。

1.5 血漿內(nèi)毒素的檢測 在無菌條件下采取腹主動脈血5 mL，采用顯色基質(zhì)鱟試劑盒，操作步驟按其說明書進(jìn)行，結(jié)果以Eu/mL表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 15.0軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組計量資料的比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腸黏膜HE染色 光鏡下觀察到正常大鼠腸黏膜組織完整，絨毛整齊，上皮細(xì)胞形態(tài)正常，未見黏膜充血水腫和炎性細(xì)胞浸潤，肝硬化伴內(nèi)毒素血癥大鼠腸黏膜絨毛稀疏、萎縮，上皮細(xì)胞壞死，黏膜水腫伴有炎性細(xì)胞浸潤(見圖1)，并且發(fā)現(xiàn)TAA組大鼠腸黏膜改變較BDL組更嚴(yán)重。

圖1 各組大鼠腸黏膜HE染色(100×)A:正常組;B:BDL組;C:TAA組Fig 1 Rat intestinal mucosa(HE 100×)A:control group;B:BDL group;C:TAA group

2.2 小腸黏膜超微結(jié)構(gòu)的改變 正常對照組沒有小腸黏膜超微結(jié)構(gòu)的改變，TAA組和BDL組大鼠小腸黏膜出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)的改變，電鏡下觀察到模型組大鼠小腸壁結(jié)構(gòu)有明顯改變，腸黏膜絨毛破壞、減少、變短、倒伏、缺失，腸黏膜緊密間隙增寬，腸黏膜杯狀細(xì)胞分泌減少，腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹(見圖2～6)。

2.3 血漿內(nèi)毒素 正常對照組血漿內(nèi)毒素素水平(0.043+0.011)Eu/mL，TAA 組血漿內(nèi)毒素水平為(0.667+0.159)Eu/mL，與正常對照組比較，顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。BDL組血漿內(nèi)毒素水平為(0.806+0.382)Eu/mL，與 TAA 組比較，顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

腸黏膜屏障功能指的是腸黏膜本身及黏膜前后因素的總稱，包括機(jī)械屏障、生物屏障和免疫屏障等，其主要作用是阻止腸道內(nèi)有害物質(zhì)(如腸內(nèi)的細(xì)菌和毒素)進(jìn)入體循環(huán)［1］。腸黏膜的機(jī)械屏障主要由腸上皮細(xì)胞及其緊密連接組成，其功能受損可以導(dǎo)致腸壁通透性增加，成為細(xì)菌及其產(chǎn)物的細(xì)胞旁通路，進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)與門靜脈循環(huán)，從而引起局部和全身的感染［2］。肝硬化機(jī)體免疫力下降等情況下，腸道內(nèi)的致病菌特別是革蘭陰性菌就會大量生長、繁殖并釋放大量的內(nèi)毒素可直接引起腸黏膜屏障損傷。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比較，藥物性肝硬化和膽汁淤積性引起的肝硬化模型組光鏡下觀察到肝硬化大鼠小腸腸黏膜絨毛稀疏、萎縮，上皮細(xì)胞壞死，黏膜水腫伴有炎性細(xì)胞浸潤，并且膽汁淤積性肝硬化病變程度較重，可能與膽汁酸分泌減少、膽鹽的缺乏等有關(guān);電鏡下觀察到模型組大鼠小腸壁結(jié)構(gòu)有明顯改變，腸黏膜絨毛破壞、減少、變短、倒伏、缺失，腸黏膜緊密間隙增寬，腸黏膜杯狀細(xì)胞分泌減少，腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。模型組血漿內(nèi)毒素水平明顯升高，并且BDL組內(nèi)毒素水平高于TAA組，推測可能內(nèi)毒素參與了機(jī)體自身免疫反應(yīng)的發(fā)生，全身免疫系統(tǒng)被激活，導(dǎo)致機(jī)體免疫紊亂。Parks等［3］學(xué)者也觀察到在膽管結(jié)扎肝硬化大鼠模型小腸黏膜形態(tài)受損，引起內(nèi)毒素水平升高和腸道細(xì)菌移位。

這些現(xiàn)象提示，肝硬化時腸黏膜結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生改變，腸黏膜屏障受損，腸壁的通透性增加，內(nèi)毒素由腸道吸收增多。進(jìn)入血循環(huán)中的內(nèi)毒素直接損傷腸黏膜上皮細(xì)胞、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并引起腸微血管收縮，使腸黏膜血流量減少，腸組織缺血、缺氧，長期缺血缺氧，又加劇內(nèi)毒素的吸收，形成惡性循環(huán)，同時，肝硬化時，Kupffer細(xì)胞功能、代謝嚴(yán)重受損對內(nèi)毒素的清除能力下降故進(jìn)入肝臟的內(nèi)毒素不能被及時清除［4］，也可引起腸源性內(nèi)毒素血癥。Such等［5］學(xué)者通過光鏡觀察到十二指腸絨毛的高度和寬度之比發(fā)生很大的變化。電鏡下觀察到肝硬化患者十二指腸黏膜的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞間隙增寬;提出肝硬化時發(fā)生感染是由于細(xì)菌通過腸黏膜屏障從腸道官腔移位到腸系膜淋巴結(jié)引起的，腸黏膜形態(tài)改變有利于細(xì)菌移位。細(xì)菌過度生長、細(xì)菌移位是肝硬化發(fā)生自發(fā)性腹膜炎的主要原因之一。我國學(xué)者任衛(wèi)英等［6］認(rèn)為小腸細(xì)菌過度生長、腸道細(xì)菌移位等同樣也是肝硬化患者易發(fā)生內(nèi)毒素血癥時不可忽視的因素，可能與正常小腸壁結(jié)構(gòu)的改變有一定的關(guān)系。同樣，Chiva等［7］學(xué)者通過實驗觀察到有細(xì)菌移位的肝硬化大鼠回腸和盲腸黏膜的氧化損傷嚴(yán)重，提出腸道黏膜屏障的完整性在肝硬化細(xì)菌移位的發(fā)病機(jī)制中可能起著重要的作用。肝硬化大鼠門脈高壓時腸道屏障完整性受損產(chǎn)生的自由基代謝物參與了肝硬化大鼠的細(xì)菌移位。Bauer等［8］學(xué)者也觀察到肝硬化患者存在小腸細(xì)菌過度生長，其與內(nèi)毒素密切相關(guān)，細(xì)菌數(shù)量可能是內(nèi)毒素水平的決定因素，而不是菌群種類組成。也有學(xué)者［9］報道肝硬化大鼠腸道菌群失調(diào)能夠引起細(xì)菌移位和肝臟功能的改變，實驗發(fā)現(xiàn)肝硬化大鼠腸道桿菌水平高于正常對照組，給予雙歧桿菌和腸球菌治療后，腸道桿菌水平和內(nèi)毒素水平都有所降低。Lata等［10］學(xué)者也報道微生態(tài)制劑可以改善肝硬化患者的腸道菌群和肝功能Child-Pugh評分，降低內(nèi)毒素水平。這些研究理論對臨床上防治肝硬化的內(nèi)源性感染和腸源性內(nèi)毒素血癥有一定的價值。

內(nèi)源性感染是肝硬化常見的并發(fā)癥之一，腸道是內(nèi)源性感染的主要來源，其中最為常見的是自發(fā)性腹膜炎和腸源性內(nèi)毒素血癥。肝硬化引起的腸源性內(nèi)毒素血癥對肝臟的損害，除內(nèi)毒素本身的直接作用外，主要與內(nèi)毒素激活巨噬細(xì)胞，使其產(chǎn)生與釋放細(xì)胞因子有關(guān)，如腫瘤壞死因子 α、白介素(IL-1、IL-6、IL-8)，血小板活化因子、白三烯、氧自由基、內(nèi)皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)等共同參與對肝組織的損傷，已有學(xué)者［11］正在臨床研究證實，膽管結(jié)扎后所致的肝硬化大鼠存在內(nèi)毒素血癥，同時腫瘤壞死因子水平顯著增高。

另外，肝硬化時，內(nèi)毒素容易進(jìn)入體循環(huán)的原因還有很多，如肝臟解毒能力下降、門體分流以及機(jī)體免疫功能受損等，同樣，內(nèi)毒素進(jìn)入人體后使機(jī)體免疫力下降［12］。

內(nèi)毒素血癥、腸黏膜屏障衰竭在晚期肝硬化患者中大量存在，阻止其惡性循環(huán)的發(fā)生是治療肝硬化患者的關(guān)鍵之一，是預(yù)防肝功能衰竭的重要環(huán)節(jié)。加強(qiáng)和深入對肝硬化患者腸黏膜屏障損傷的研究對防治腸源性內(nèi)毒素血癥具有重要意義。有報道［13］:西沙比利通過促進(jìn)小腸蠕動和改善腸道滲透率可能有助于防止腸道細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥。因此，通過調(diào)節(jié)腸道菌群、增加腸道動力、營養(yǎng)支持等方面來防治肝硬化內(nèi)毒素血癥的發(fā)生。

［1］ Ren WY，Zhang SC，Tu CT，et al.The relationship between small intestinal mucosa injury and intestinal endotoxemia in cirrhotic rats［J］.Fudan Univ J Med Sci，2008，35(1):125-127.

任衛(wèi)英，張順財，涂傳濤，等.肝硬化大鼠小腸微絨毛形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的改變與腸源性內(nèi)毒素血癥的關(guān)系［J］.復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2008，35(1):125-127.

［2］ Li J，Cheng LF，Du B，et al.The study of morphology of intestinal mucosa and bacterial translocation in the rat of cirrhosis［J］.Chin J Gastroenterol Hepatol，2010，19(1):25-27.

李靜，程留芳，杜斌，等.肝硬化大鼠模型腸壁結(jié)構(gòu)及細(xì)菌移位的研究［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2010，19(1):25-27.

［3］ Parks RW，Stuart Cameron CH，Gannon CD，et al.Changes in gastrointestinal morphology associated with obstructive jaundice［J］.J Pathol，2000，192(4):526-532.

［4］ Li QY，Shu JH，Yang JH.Relationship between ultrasturctural changes of small intestinal mucosa and plasma endotoxin in patients with cirrhosis［J］.The Journal of Practical Medicine，2006，22(7):777-779.

李琪毅，舒建昌，楊綺紅.肝硬化患者小腸黏膜超微結(jié)構(gòu)改變與內(nèi)毒素血癥［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2006，22(7):777-779.

［5］ Such J，Guardiola JV，de Juan J，et al.Ultrastructural characteristics of distal duodenum mucosa in patients with cirrhosis［J］.Eur Gastroenterol Hepatol，2002，14(4):371-376.

［6］ Ren WY，Zhang SC，Zhou ZY，et al.The relationships between the histological changes of the small intestine and small intestine bacterial overgrowth and bacterial translocation in cirrhotic rats［J］.Clinical Medical Journal of China，2004，11(2):168-170.

任衛(wèi)英，張順財，周昭彥，等.肝硬化大鼠小腸壁結(jié)構(gòu)改變與小腸細(xì)菌過度生長和細(xì)菌轉(zhuǎn)位的關(guān)系的研究［J］.中國臨床醫(yī)學(xué)，2004，11(2):168-170.

［7］ Chiva M，Guarner C，Peralta C，et al.Intestinal mucosal oxidative damage and bacterial translocation in cirrhotic rats［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol，2003，15(2):146-149.

［8］ Bauer TM，Schwacha H，Steinbruckner B，et al.Small intestinal bacterial overgrowth in human cirrhosis is associated with systemic endotoxemia［J］.Am J Gastroenterol，2002，97(9):2364-2370.

［9］ Zhang W，Gu Y，Chen Y，et al.Intestinal flora imbalance results in altered bacterial translocation and liver function in rats with experimental cirrhosis［J］.Eur Gastroenterol Hepatol，2010，14(4):371-376.

［10］ Lata J，Novotny I，Pribramska V，et al.The effect of probiotics on gut flora，level of endotoxin and Child-Pugh score in cirrhotic patients:results of a double-blind randomized study［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol，2007，19(12):1111-1113.

［11］ Yorganci K，Baykal A，Kologlu M，et al.Endotoxin challenge causes a proinflammatory state in obstructive jaundice［J］.J Invest Surg，2004，17(3):119-126.

［12］ Lin CY，Tsai IF，Ho YP，et al.Endotoxemia contributes to the immune paralysis in patients with cirrhosis［J］.J Hepatol，2007，46(5):816-826.

［13］ Zhang SC，Wang W，Ren WY，et al.Effect of cisapride on intestinal bacterial and endotoxin translocation in cirrhosis［J］.World J Gastroenterol，2003，9(3):534-538.