奧曲肽對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠枯否細(xì)胞m2極化功能的調(diào)節(jié)作用

牟 佼，孫 輝，丁 震，劉 俊

1.華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢430022;2.陜西省西安市中心醫(yī)院消化內(nèi)科

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是臨床常見危重癥，普遍認(rèn)為炎性因子的產(chǎn)生及其級(jí)聯(lián)的“瀑布效應(yīng)”是胰腺由局部炎癥發(fā)展為威脅生命的全身炎癥的關(guān)鍵。臨床上奧曲肽多年來被用于急性胰腺炎的治療，但其治療機(jī)制并不十分清楚。近來有大量研究表明肝臟Kupffer細(xì)胞可能是急性胰腺炎時(shí)炎性因子的主要來源，我們從奧曲肽治療SAP時(shí)血清和Kupffer細(xì)胞內(nèi)的炎癥因子的動(dòng)態(tài)變化著手，探討肝Kupffer細(xì)胞在SAP中的作用及奧曲肽對(duì)Kupffer細(xì)胞m2極化功能的調(diào)節(jié)作用，為臨床應(yīng)用奧曲肽治療急性胰腺炎奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠36只(購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)醫(yī)院動(dòng)物中心)，體質(zhì)量200～250 g。奧曲肽購(gòu)自Novartis Pharma Schweiz AG公司，牛黃膽酸鈉購(gòu)自ACROS ORGANICS，膠原酶Ⅳ購(gòu)自GIBCO公司，Percoll液購(gòu)自GE Healthcare Bio-Science AB公司，免疫熒光抗體F4/80購(gòu)自Abcam公司，DAB染色劑購(gòu)自武漢生命科技有限公司，Elisa試劑盒購(gòu)自 ebioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模:隨機(jī)分為6組:假手術(shù)組(S)、SAP組、奧曲肽治療組(ST)、生理鹽水治療組(NT)、奧曲肽預(yù)防組(SP)、生理鹽水預(yù)防組(NP)。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠進(jìn)行無菌手術(shù)，開腹后，將靠近肝門段的膽胰管先以小動(dòng)脈夾予以夾閉，經(jīng)胰管逆行緩慢注射5%牛黃膽酸鈉，注射完畢后退出針頭用手壓迫進(jìn)針處約3 min。觀察胰腺出現(xiàn)均勻性的出血、腫脹、滲出，確定SAP模型成功，關(guān)腹。假手術(shù)組開腹后僅翻動(dòng)腸道數(shù)次后關(guān)腹。奧曲肽治療組于造模后0、8、16 h腹部皮下注射奧曲肽 20 μg/μL，奧曲肽預(yù)防組造模前 1 h，造模后 8、16 h腹部皮下注射奧曲肽，它們的對(duì)照組分別于相同的時(shí)間點(diǎn)腹部皮下注射等量生理鹽水。

1.2.2 Kupffer細(xì)胞的分離和提取:24 h后麻醉大鼠開腹，下腔靜脈取血，3 000 r/min，離心20 min，取血清置－70℃冷藏備用。門靜脈插管手術(shù)縫線固定，先用無Ca2+Mg2+的HBSS液250 mL勻速灌注，沖洗肝臟內(nèi)的紅細(xì)胞;再用含0.02%膠原酶Ⅳ的HBSS液750 mL勻速緩慢灌注，注意保持灌注溫度(37℃)，盡量保證肝包膜完整，待肝臟變軟結(jié)構(gòu)塌陷，將其完整分離，浸泡入50 mL HBSS液中，移入超凈臺(tái)進(jìn)行分離和提取Kupffer細(xì)胞。將肝包膜撕去，用加樣槍反復(fù)吹打液體使細(xì)胞充分懸浮，再將其倒入50 mL離心管，70×g，3 min離心，留沉淀;取上清繼續(xù)70×g，3 min離心，棄沉淀，留上清;將上兩步的沉淀和上清混勻，650×g，7 min離心，取沉淀;在15 mL離心管中先加入50%Percoll液4 mL，再緩慢加入25%Percoll液4 mL，最后將2 mL細(xì)胞液緩慢加入最上面，1 800×g，15 min，將離心機(jī)的brake調(diào)為0;離心后管內(nèi)液體分為四層，最上層為星狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，最下層為破碎的紅細(xì)胞，都棄去，用玻璃滴管吸取中間兩層，再650×g，7 min離心，棄去上清則為所需的較純 Kupffer細(xì)胞。將Kupffer細(xì)胞用20%培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h，棄去上清液，貼壁的為Kupffer細(xì)胞。

1.2.3 Kupffer細(xì)胞的鑒定:DAB染色和免疫熒光染色，光鏡下計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算存活率。DAB染色實(shí)驗(yàn):Kupffer細(xì)胞培養(yǎng)2 h后，將6孔板中的上清液吸盡，1.5%戊二醛固定10 min，吹干;用PBS洗2次，每次 3 min ，0.05%DAB+0.03%H2O2混合后立即使用;室溫下作用顯微鏡下立即觀察，黃染呈“煎蛋樣”的細(xì)胞為Kupffer細(xì)胞(見圖1)。

免疫熒光染色:F4/80一抗1∶100稀釋，每孔100 μL，4℃過夜;FITC羊抗兔二抗1∶100稀釋，每孔100 μL，室溫1 h，避光;hoechst33258 染色液 1∶1000 稀釋，每孔100 μL，室溫10 min避光。

1.2.4 血清中 TNF-ɑ、IL-4、IL-10 水平的檢測(cè):采用ELISA法，按照試劑說明書操作，酶標(biāo)儀讀值后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算因子濃度。

1.2.5 肝 Kupffer細(xì)胞內(nèi) TNF-ɑ、IL-4、IL-10 表達(dá)的檢測(cè):用Trizol提取Kupffer細(xì)胞內(nèi)的RNA。RT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件:95℃10 min、95℃15 s、60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。引物由上海英駿公司合成，序列如下:GAPDH:上游:5'-GTATGACTCTACCCACGGCAAGT-3';下游:5'-TTCCCGTTGATGACCAGCTT-3'。TNF-ɑ:上游:5'-CCGATTTGCCACTTCATACCA-3';下游:5'-TAGGGCAAGGGCTCTTGATG-3'。IL-4:上游:5'-CAGACGTCCTTACGGCAACA-3';下游:5'-CTGGAAGCCCTGCAGATGA-3'。IL-10:上游:5'-AGAAGGACCAGCTGGACAACAT-3';下游:5'-CAAGTAACCCTTAAAGTCCTGCAGTA-3'。

1.2.6 胰腺組織病理學(xué)檢查:取胰腺組織4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色后顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Kupffer細(xì)胞成功培養(yǎng)及鑒定 特異性標(biāo)記抗體F4/80免疫熒光染色可見呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形的Kupffer細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù) Kupffer細(xì)胞約為(4～7)×106，細(xì)胞存活率＞87%(見圖2)。

2.2 胰腺病理改變 光鏡下假手術(shù)組胰腺組織大致正常。SAP組可見大量出血、間質(zhì)水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、小葉輪廓消失，甚至滿視野充滿紅細(xì)胞，腺細(xì)胞成大片狀壞死。NT組和NP組可見胰腺腺泡壞死、出血、大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。ST組和SP組炎癥反應(yīng)明顯減輕(見圖3)。

圖1 DAB染色“煎蛋樣”Kupffer細(xì)胞(SP 400×);圖2 免疫熒光染色可見不規(guī)則多邊形的Kupffer細(xì)胞(SP 400×);圖3 各組胰腺病理改變(SP 400×)A:SAP組;B:生理鹽水治療組;C:生理鹽水預(yù)防組;D:假手術(shù)組;E:奧曲肽治療組;F:奧曲肽預(yù)防組Fig 1 “Omelette-like”Kupffer cells by DAB staining(SP 400×);Fig 2 Immunofluorescence staining showed Kupffer cells of irregular polygons(SP 400×);Fig 3 Pathological changes of the pancreas with S，SAP，Octreotide and normal saline groups(SP 400×)A:SAP group;B:NS therapy group;C:NS prophylaxis group;D:S group;E:Octreotide therapy group;F:Octreotide prophylaxis group

2.3 血清中 TNF-α、IL-4、IL-10水平檢測(cè) SAP組、生理鹽水治療組和預(yù)防組TNF-α的水平明顯升高，與奧曲肽治療組相比差異顯著(P＜0.05或0.01)，與奧曲肽預(yù)防組比較并無明顯差異。奧曲肽治療組和預(yù)防組IL-4水平明顯增高，與其他組相比有顯著差異(P＜0.01)，而其兩組之間IL-4水平無差異。IL-10水平在奧曲肽治療組明顯升高，與SAP組、生理鹽水治療組和預(yù)防組相比差異顯著(P＜0.01)，而IL-10水平在奧曲肽預(yù)防組并未見明顯升高，與奧曲肽治療組相比有明顯差異(P＜0.05，見表1)。

表1 血清中 TNF-α、IL-4、IL-10 水平 (x－ ± s)Tab 1 Levels of TNF-α，IL-4 and IL-10 in serum(x－ ± s)

2.4 奧曲肽可誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞的m2極化 與假手術(shù)組相比，TNF-α在SAP組的表達(dá)明顯上升(P＜0.01)，而其在奧曲肽治療組和預(yù)防組的表達(dá)明顯降低，與假手術(shù)組、SAP組比較差異顯著(P＜0.01)。IL-4的表達(dá)量SAP組與假手術(shù)組相比明顯下降(P＜0.01)，而其在奧曲肽治療組和預(yù)防組的表達(dá)量明顯上升，與SAP組、生理鹽水治療組和預(yù)防組相比差異顯著(P＜0.05或0.01)。SAP組與假手術(shù)組相比，IL-10的表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)，而其表達(dá)量在奧曲肽治療組和預(yù)防組明顯升高，與假手術(shù)組、SAP組、生理鹽水治療組和預(yù)防組相比差異明顯(P＜0.01或0.05)(見表2)。

表2 Kupffer細(xì)胞中 TNF-α，IL-4，IL-10 表達(dá)水平(±s)Tab 2 Expression levels of TNF-α，IL-4 and IL-10 in Kupffer cells(±s)

表2 Kupffer細(xì)胞中 TNF-α，IL-4，IL-10 表達(dá)水平(±s)Tab 2 Expression levels of TNF-α，IL-4 and IL-10 in Kupffer cells(±s)

與S組、ST組和SP組相比，aP＜0.01;與SAP組、NT組和NP組相比，bP ＜0.01，cP ＜0.05;與 SAP 組相比，fP ＜0.01，與 S組、SAP組、NT組和 NP組相比，dP ＜0.01，eP＜0.05

組別 TNF-α(ng/L)IL-4(ng/L)IL-10(ng/L)S 1.00 ±0.10 1.03 ±0.28b 1.004 ±0.09f SAP 10.61 ±1.18a 0.01 ±0.002 0.17 ±0.23 ST 0.33 ±0.08 1.60 ±0.57c 5.21 ±1.10d NT 3.24 ±2.30 0.003 ±0.001 0.66 ±0.12 SP 0.31 ±0.06 0.6 ±0.17b 26.44 ±11.83e NP 21.6 ±12.55 0.08 ±0.02 1.02 ±0.35

3 討論

重癥急性胰腺炎實(shí)質(zhì)上是一種嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，普遍認(rèn)為各種有害物質(zhì).致病因子刺激胰腺腺泡細(xì)胞，引起細(xì)胞損傷，導(dǎo)致胰酶釋放，激活中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放大量炎性因子，而這些因子通過“扳機(jī)樣作用”產(chǎn)生連鎖和放大效應(yīng)，導(dǎo)致多器官損傷。那么在SAP中這些炎癥因子主要是從哪里產(chǎn)生的呢?

肝Kupffer細(xì)胞是人體組織內(nèi)的最大定居巨噬細(xì)胞群，約占巨噬細(xì)胞的80% ～90%。SAP時(shí)，胰腺組織大量壞死，導(dǎo)致胰酶異常激活后進(jìn)入血液，同時(shí)釋放大量的炎癥因子，而胰腺的血液必須先經(jīng)過肝臟的處理后才入體循環(huán)，所以Kupffer細(xì)胞在胰腺炎的發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到關(guān)注。Gloor等［1-2］的研究表明SAP時(shí)，肝臟在處理各種有毒物質(zhì)和炎性因子過程中，會(huì)激活Kupffer細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致其釋放大量炎癥介質(zhì)，在SAP的發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。

Folch-puy等［3］報(bào)道了門體斷流術(shù)可以預(yù)防急性胰腺炎模型中肺損傷的發(fā)生;隨后又有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示急性胰腺炎時(shí)肝靜脈中細(xì)胞因子的濃度明顯高于門靜脈［4］;進(jìn)一步人們用Kupffer細(xì)胞的特異性抑制劑氯化釓可以預(yù)防SAP所致的呼吸衰竭［5］。而大量實(shí)驗(yàn)也表明活化的Kupffer細(xì)胞可產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，例如TNF-α、IL-1β、IL-6等，這些因子增加毛細(xì)血管的通透性，促進(jìn)白細(xì)胞的黏附、聚集和滲出，導(dǎo)致多器官的損害，阻斷Kupffer的這些作用能明顯改善SAP的預(yù)后率和死亡率。

Kupffer細(xì)胞是巨噬細(xì)胞的一種，有研究表明成熟巨噬細(xì)胞在不同的微環(huán)境中可被誘導(dǎo)分化出不同的表型和功能狀態(tài)，稱為巨噬細(xì)胞的極化［6］，主要有兩種極化狀態(tài)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的巨噬細(xì)胞狀態(tài)被稱為m1極化，而與其相對(duì)抑制炎癥反應(yīng)的巨噬細(xì)胞狀態(tài)稱為m2極化［7-8］。極化細(xì)胞的重要特征為產(chǎn)生不同細(xì)胞因子。m2極化的巨噬細(xì)胞通過分泌炎癥調(diào)節(jié)因子IL-4、IL-10和/或TGF-β等，下調(diào)免疫應(yīng)答，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉淀，并加速組織的修復(fù)［9］。Zhang等［10］發(fā)現(xiàn)大鼠SAP造模前或后給予IL-4均能減輕胰腺組織的壞死程度。Kusske等［11］采用IL-10預(yù)處理和治療ANP小鼠，均降低了SAP的嚴(yán)重程度和死亡率。

盡管有明確的研究結(jié)果顯示奧曲肽通過多種途徑對(duì)急性胰腺炎產(chǎn)生保護(hù)作用，但是對(duì)奧曲肽是否作用于處于急性胰腺炎炎癥核心的Kupffer細(xì)胞，是否介導(dǎo)了Kupffer細(xì)胞的m2極化尚未見報(bào)道。我們擬通過體內(nèi)試驗(yàn)來觀察奧曲肽對(duì)Kupffer細(xì)胞的作用。通過急性胰腺炎造模前后給予奧曲肽干預(yù)，檢測(cè)血清中TNF-α、IL-4、IL-10水平，通過在體肝臟灌流密度梯度離心法提取Kupffer細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-4、IL-10的表達(dá)來確定奧曲肽的體內(nèi)效應(yīng)，病理組織切片觀察胰腺的病理改變。我們發(fā)現(xiàn)奧曲肽治療組和預(yù)防組的大鼠死亡率明顯降低，開腹后出現(xiàn)腹水和鈣化灶的情況較少。胰腺組織病理切片可見SAP組胰腺小葉結(jié)構(gòu)消失，組織間質(zhì)水腫，大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，甚至鏡下滿視野充滿紅細(xì)胞，組織大片狀壞死;生理鹽水治療組和預(yù)防組亦可見胰腺組織的出血壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但反應(yīng)較SAP組輕;而奧曲肽治療組和預(yù)防組胰腺組織炎癥反應(yīng)明顯減輕。

IL-4參與機(jī)體體液免疫應(yīng)答，它促進(jìn)Th2細(xì)胞分化，產(chǎn)生IL-4、IL-10等炎癥調(diào)節(jié)因子，在防御細(xì)胞外病原菌和某些自身免疫性疾病中有著重要作用。有研究表明IL-4通過抑制巨噬細(xì)胞的活化和聚集來顯示它的抗炎特性［12］。Hart等［13］的體外研究顯示，IL-4 在mRNA水平上抑制TNF-α和IL-1β的表達(dá)，減少其生成。IL-4亦可以上調(diào)IL-1受體拮抗劑的表達(dá)［14］，刺激巨噬細(xì)胞15-脂氧化酶活性［15］，這些功能對(duì)于我們控制SAP過程中常見的系統(tǒng)炎癥反應(yīng)有重要意義。從我們的實(shí)驗(yàn)也得出奧曲肽治療組Kupffer細(xì)胞內(nèi)IL-4的表達(dá)升高，相應(yīng)的TNF-α表達(dá)減少，在血清中也可見IL-4增多而TNF-α降低。

抑炎因子IL-10主要是抑制巨噬細(xì)胞向Th1細(xì)胞遞呈抗原，減少巨噬細(xì)胞MHC-2類分子的表達(dá)，從而抑制TNF-α等炎性因子的產(chǎn)生。而目前的實(shí)驗(yàn)研究表明，IL-10是通過抑制NF-κB的激活在轉(zhuǎn)錄水平抑制炎性介質(zhì)的產(chǎn)生［16-17］。Van Laethem 等［18］發(fā)現(xiàn)注射IL-10單克隆抗體可使AP小鼠病情加重，在抵消了內(nèi)源性IL-10作用的同時(shí)，使肝臟胰腺TNF-α mRNA表達(dá)增加。在我們的實(shí)驗(yàn)中也觀察到了，奧曲肽治療組Kupffer細(xì)胞內(nèi)的IL-10表達(dá)增加，相應(yīng)的TNF-α mRNA的表達(dá)減少。提示奧曲肽可能通過影響IL-10抑制NF-kB的激活抑制了TNF-α的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，同時(shí)血清中IL-10的水平顯著升高TNF-α水平降低。

在國(guó)外的研究中，奧曲肽治療或預(yù)防性應(yīng)用于急性重癥胰腺炎大鼠，得到了不同的結(jié)果，而在本試驗(yàn)中得出奧曲肽治療組的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果優(yōu)于奧曲肽預(yù)防組，我們推測(cè)奧曲肽作用于“活化”狀態(tài)Kupffer細(xì)胞的效果優(yōu)于“靜止”狀態(tài)Kupffer細(xì)胞。

綜上所述，血清和Kupffer細(xì)胞中因子的變化水平與胰腺的病理變化呈一致性趨勢(shì)，Kupffer細(xì)胞在重癥急性胰腺炎中起著重要的作用，奧曲肽通過作用于Kupffer細(xì)胞，導(dǎo)致其促炎因子TNF-α表達(dá)分泌的減少，抑炎因子IL-4、IL-10表達(dá)分泌的增加，從而介導(dǎo)了Kupffer細(xì)胞的m2極化，抑制促炎因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)抑炎因子的表達(dá)，減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)，對(duì)重癥急性胰腺炎起到了調(diào)節(jié)治療作用。

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