熊去氧膽酸對肝癌模型大鼠γ－谷氨酰轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的影響

盛 瑜，韓國慶，秦成勇，任萬華，劉 慧，王夏青

山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院1.感染性疾病科;2.消化內(nèi)科，山東濟南250012

目前研究發(fā)現(xiàn)，在正常人肝細(xì)胞中存在γ-GGT不同的基因亞型:胎肝型(F)、胎盤型(H)、肝癌細(xì)胞型(P)亞型，并與肝癌發(fā)展密切相關(guān)［1］。根據(jù)國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，熊去氧膽酸(UDCA)對人宮頸癌細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用，并可抑制致癌物對實驗動物的致癌作用［2-3］。在此基礎(chǔ)上，研究發(fā)現(xiàn)UDCA能選擇性誘導(dǎo)人肝腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制增殖［4］。在上述系列研究中，本實驗主要研究UDCA對大鼠肝癌模型中肝癌標(biāo)志物GGT基因表達(dá)的影響作用，進(jìn)一步探討UDCA對肝癌預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Wister大鼠106只，雄性，年齡3.5個月，體質(zhì)量(95.9±5.6)g，購于山東大學(xué)動物實驗中心。二乙基亞硝胺(DEN)，UDCA及逆轉(zhuǎn)錄酶和PCR試劑，均為Sigma產(chǎn)品。

1.2 大鼠肝癌模型的建立 將106只Wister大鼠隨機分成5組:① 模型組28只;② UDCA實驗A組28只;③UDCA實驗B組28只;④正常對照組11只;⑤UDCA對照組11只。①②③組為實驗組，④⑤組為對照組。模型組在正常飲水、進(jìn)食狀態(tài)下飼養(yǎng)2周，于第3周開始給予每只大鼠腹腔注射DEN溶液(2 g/L)，劑量為20 mg/kg，每周1次，共2周;于第5周增加DEN劑量為40 mg/kg;第7周始增加DEN劑量為60 mg/kg，按上述方法注射2周。之后在正常飲食下飼養(yǎng)至20周，總時間為28周。UDCA實驗A組將UDCA用飲用水配成2 g/L的濃度，給大鼠飲用2周，于第3周給予腹腔注射DEN溶液，劑量、用法和時間與模型組相同。UDCA實驗B組UDCA的濃度增加為5 g/L，其他處理與UDCA實驗A組相同。正常對照組不給予大鼠任何處理。UDCA對照組除不用DEN腹腔注射外，其余處理同UDCA實驗B組。

1.3 大鼠的處死及處理 大鼠肝組織的采集:將大鼠處死，取各組大鼠肝組織、癌周組織及癌組織標(biāo)本，以無RNA酶的三蒸水沖洗后置于EP管中，轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存，供提取GGT mRNA。血液標(biāo)本的采集:處死大鼠時，抽取腹主動脈血，枸櫞酸鈉抗凝，分離血液中的單個核細(xì)胞(PMNs)，再提取其總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA放入－80℃冰箱保存。

1.4 GGT mRNA各亞型的引物 (由上海生工生物工程公司合成)，GGT mRNA各亞型引物序列如下:F亞型:上游 5'-CACAGGGGACATACAGTGAG-3'，下游5'-GAAATAGCTGAAGCACGCGC-3';H亞型:上游 5'-GGATTCTCCCAGAGATTGCC-3'，下 游 5'-GGAGGTCAAGGG AGGTTACC;P亞型:上游5'-GCCCAGAAGTGAGAGCAGTT-3'，下 游 5'-TCCAGAAAGCAGCTAGA GGG-3';β-actin:上游 5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'，下游 5'-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3'。

1.5 PT-PCR方法 對血液標(biāo)本，用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PMNs)。對肝組織標(biāo)本，在冷凍狀態(tài)下剪取50～100 mg肝組織，提取RNA，合成cDNA，然后進(jìn)行PCR基因擴增，反應(yīng)條件均為:預(yù)變性94℃ 3 min;變性94℃ 30 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，循環(huán)30次;最后72℃ 延伸8 min，得到反應(yīng)終產(chǎn)物，預(yù)期終產(chǎn)物分子大小。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 以SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。計數(shù)資料用χ2檢驗;計量資料先行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間的比較采用單因素方差分析LSD法。以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEN誘癌過程中GGT基因的表達(dá)及其與人類GGT基因表達(dá)的異同 模型組8只非肝癌大鼠、20只肝癌大鼠(取其癌周組織、癌組織)及正常對照組的11只正常大鼠肝組織3種GGT mRNA亞型，分析結(jié)果:正常肝組織中只檢出F亞型(100%);非肝癌肝組織F亞型的陽性率與正常大鼠相同，但H亞型的檢出率明顯高于正常大鼠(P＜0.05)(此點與人類不同);癌周組織F亞型的分布與非肝癌及正常大鼠相似，但H亞型陽性率明顯高于正常及非肝癌大鼠;癌組織F亞型陽性率顯著低于其他3組，H亞型陽性率明顯高于正常及非肝癌大鼠，與癌周組織相似(P＜0.05);在大鼠肝組織中未檢測出P亞型(此點與人類不同)(見表1、圖1)。

表1 大鼠不同類型肝組織GGT基因(F、H)的表達(dá)Tab 1 GGT gene expression(F，H)in rat different liver tissues

圖1 大鼠不同類型肝組織GGT基因亞型的分布情況Fig 1 GGT gene subtypes distribution in rat liver tissues

2.2 實驗大鼠血液中GGT mRNA亞型的表達(dá) 通過對模型組中8只非肝癌大鼠、20只肝癌大鼠和正常對照組中11只正常大鼠腹主動脈血液的GGT基因亞型檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常及非肝癌大鼠血液中未檢出GGT mRNA各亞型;在肝癌大鼠的血液中GGT mRNAH的檢出率為40%，明顯高于非肝癌及正常大鼠。

2.3 UDCA對實驗大鼠肝組織GGT基因表達(dá)的影響 通過對各組實驗大鼠肝組織、癌周組織和癌組織GGT mRNA H和F亞型的半定量PT-PCR分析發(fā)現(xiàn):UDCA實驗A、B組的非肝癌大鼠肝組織、肝癌大鼠的癌周圍組織和癌組織的GGT mRNA-H亞型的表達(dá)量均較模型組明顯下降(P＜0.05);UDCA實驗A、B組癌組織F亞型的表達(dá)量較模型組顯著提高;正常對照組與UDCA對照組相比較，H及F亞型的表達(dá)量相似(P ＜0.05，見表2、3)。

表2 UDCA對大鼠肝組織GGT mRNA-H表達(dá)的影響Tab 2 The expression of GGT mRNA-H by UDCA in rat liver tissues

表3 UDCA對大鼠肝組織GGT mRNA-F表達(dá)的影響Tab 3 The expression of GGT mRNA-F by UDCA in rat liver tissues

2.4 UDCA對大鼠血液GGT mRNA-H表達(dá)的影響通過對模型組，UDCA實驗A、B組中發(fā)生癌變的大鼠血液的GGT mRNA-H的基因半定量分析顯示:UDCA實驗A、B組的GGT mRNA-H表達(dá)量較模型組明顯減少(P ＜0.05，見表4)。

表4 UDCA對大鼠血液GGT mRNA-H表達(dá)的影響Tab 4 The expression of GGT mRNA-H by UDCA in rat blood

3 討論

肝癌發(fā)生的分子機制根本原因在于癌基因及癌相關(guān)基因的激活及抑癌基因的失活，使調(diào)控發(fā)生異常，導(dǎo)致癌變［5］。GGT在正常肝組織GGT活性較低，肝細(xì)胞發(fā)生癌變時，肝GGT重新大量表達(dá)，并且出現(xiàn)較明顯的異質(zhì)性改變［6-7］。本實驗成功建立大鼠肝癌模型，通過化學(xué)誘癌，導(dǎo)致原癌基因和(或)抑癌基因失活，發(fā)生癌變?；瘜W(xué)致癌劑在體內(nèi)通過酶的作用將其轉(zhuǎn)變?yōu)楹軓姷挠H電子劑，它與膜結(jié)合的GGT有高度的親和力和反應(yīng)力。當(dāng)肝組織癌變時，可產(chǎn)生和分泌與肝癌相關(guān)的GGT，被認(rèn)為是肝癌發(fā)生的早期標(biāo)志酶。

γ-GGT既與生物轉(zhuǎn)化、核酸代謝及腫瘤發(fā)生有關(guān)，又是反映肝細(xì)胞實質(zhì)惡性病變的靈敏標(biāo)志酶［8］。肝臟GGT基因亞型分為3種:胎肝(F)、胎盤(P)和肝癌細(xì)胞型(H)亞型。人胎肝及肝癌組織GGT約為正常肝的3～13倍。鼠肝癌的研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織及胎鼠GGT的比活性甚高，約為正常鼠肝GGT的100倍。本研究通過DEN誘發(fā)大鼠肝癌模型，其與人的肝細(xì)胞癌比較相似，實驗證明正常肝、非肝癌組織及癌周組織主要表達(dá)F亞型;肝癌組織中H亞型陽性率明顯高于非腫瘤組，而F亞型的陽性率明顯低于非腫瘤組;癌周組織F亞型陽性率與非腫瘤組相似。在癌變大鼠的血液中均可檢出GGT mRNA-H亞型，而非肝癌者血液中未檢出H亞型。F及P亞型均未檢出，說明人與大鼠血液中GGT基因亞型的分布是相近的。由此我們可以推測在肝癌發(fā)生過程中存在著GGT mRNA由F亞型向H亞型的轉(zhuǎn)變，肝細(xì)胞的F亞型向H亞型的轉(zhuǎn)化可能發(fā)生于癌前期病變。而在血液中檢出H亞型是血液中存在肝癌細(xì)胞的標(biāo)志，說明GGT mRNA-H亞型的表達(dá)可能成為肝癌早期的靈敏指標(biāo)。實驗證明大鼠與人的GGT的基因表達(dá)的結(jié)果相一致。

目前認(rèn)為，熊去氧膽酸是臨床上用于利膽、保護(hù)細(xì)胞及免疫調(diào)節(jié)等作用的一線藥物。UDCA能減少結(jié)腸癌的發(fā)生，抑制致癌物對實驗動物的致癌作用。本實驗已證實大鼠與人的GGT mRNA表達(dá)結(jié)果是一致的。通過研究發(fā)現(xiàn)UDCA可以減少DEN誘癌過程中大鼠肝組織、癌周組織及癌組織GGT mRNA-H亞型的表達(dá)水平，而GGT mRNA-H亞型的表達(dá)與肝癌的發(fā)生及癌前病變有密切關(guān)系，與我們先前的實驗研究UDCA可以減少大鼠癌結(jié)節(jié)的數(shù)量、降低AFP水平的結(jié)果相一致。進(jìn)一步說明UDCA能減少肝癌的發(fā)生，對預(yù)防肝癌有一定的作用，并且UDCA也降低血液中GGT mRNA-H的表達(dá)水平，而血液中GGT mRNA-H亞型是血液中存在肝癌細(xì)胞的標(biāo)志，說明UDCA可以減少肝癌大鼠血液中肝癌細(xì)胞的數(shù)量，提示其具有預(yù)防或減少實驗大鼠血液播散的作用。綜上所述，UDCA可以減少實驗大鼠肝組織及血液中GGT mRNA-H亞型的表達(dá)，提示UDCA具有預(yù)防或減少肝癌發(fā)生和血液播散的作用。

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