Maspin、bFGF在宮頸病變中的表達(dá)及與高危型HPV的相關(guān)性研究

陳 輝，米淑玲，尹利榮，馬洪達(dá)，孫俊杰，王宇全

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科，天津300211）

宮頸癌（cervical cancer,CC）已被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為威脅女性生命的第二大惡性腫瘤。有研究顯示，99.8%的宮頸癌合并高危型人乳頭瘤病毒（高危型HPV）感染，其通過病毒基因蛋白與細(xì)胞癌基因和抑癌基因相互作用,干擾細(xì)胞的正常周期監(jiān)測機(jī)制,使宿主細(xì)胞獲得異常增殖能力而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,這是高危型HPV致癌的中心環(huán)節(jié)，但宮頸病變?nèi)绾斡陕詫m頸炎→宮頸上皮內(nèi)瘤樣變（CIN）→宮頸癌，目前國內(nèi)外學(xué)者正從不同的角度進(jìn)行研究和探索。乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑（Maspin）基因是最新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，研究證實(shí)其在某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用；堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）是一種廣譜的有絲分裂原，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，但有關(guān)高危型HPV感染的宮頸病變患者中兩者的研究少見報(bào)道。本研究通過免疫組化法檢測Maspin、bFGF在宮頸病變中的表達(dá)情況，探討兩者在宮頸病變發(fā)展過程中的相關(guān)性及與高危型HPV感染的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料 收集2009年3月-2010年12月在天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科行宮頸手術(shù)或活檢病人的宮頸石蠟組織標(biāo)本共166例，其中高危型HPV（+）組106例：慢性宮頸炎組20例、CIN組共60例（CINⅠ級20例、CINⅡ級20例、CINⅢ級20例）及宮頸癌組26例；HPV（-）CIN組共60例：CINⅠ級35例、CINⅡ級20例、CINⅢ級5例。慢性宮頸炎組、CINⅠ級組、CINⅡ級組、CINⅢ級組及宮頸癌組平均年齡分別為（35.40±6.51）歲、（38.13+7.36）歲、（37.92+8.14）歲、（37.83+6.80）歲、（37.26+6.99）歲，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）?；颊呔鶡o其它惡性腫瘤病史，獲取標(biāo)本前均未接受過放療及化療，均經(jīng)病理檢查證實(shí)診斷。

1.2 試劑和方法 采用兔抗人Maspin單克隆抗體（美國SantaCruz公司），稀釋濃度為1∶75，兔抗人bFGF單克隆抗體（美國SantaCruz公司），稀釋濃度為1∶75。即用型免疫組化試劑盒購自天津?yàn)笊镏破酚邢薰?。選取患者的宮頸活檢標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為4 μm，采用免疫組化SP法，增敏二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，具體操作按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷 Maspin主要定位于細(xì)胞核，bFGF主要定位于細(xì)胞漿，但兩者評判均以細(xì)胞核和（或）漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。根據(jù)著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行綜合評定。（1）著色強(qiáng)度計(jì)分判定：無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深褐色為3分。（2）染色的陽性細(xì)胞所占比例評定標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)切片隨機(jī)抽取5個(gè)高倍視野，陽性細(xì)胞數(shù)<5%為 0分，5%～25%為 1分，26%～50%為 2分，51%～75%為3分，>75%為4分。2種評分相加，將結(jié)果分為 4個(gè)等級，0～1分為-，2分為+，3～4分為++，5～7 分為+++，將+～+++均記為陽性計(jì)算陽性率，陽性率=陽性例數(shù)/觀察總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSSl3.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)數(shù)資料樣本率之間的比較采用χ2檢驗(yàn)，Maspin、bFGF及高危型HPV三者的相關(guān)性均采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Maspin、bFGF 在高危型 HPV（+）組不同宮頸組織中的表達(dá)情況

2.1.1 Maspin蛋白在高危型HPV（+）組不同宮頸組織中的陽性表達(dá)率逐漸下降（P<0.05）；在慢性宮頸炎、CIN I級、CINⅡ級組織中的表達(dá)相比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在CINⅢ級、宮頸癌組中Maspin蛋白的表達(dá)率同其它各組相比，以及這兩組之間相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見表1。

表1 Maspin蛋白在高危型HPV（+）宮頸組織中的表達(dá)Tab 1 The expression of Maspin protein in high-risk type HPV+cervical carcinoma

2.1.2 bFGF蛋白在高危型HPV（+）不同宮頸組織中的陽性表達(dá)率逐漸增加（P<0.05），在慢性宮頸炎組的表達(dá)同CINⅢ級、宮頸癌組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；CIN各組間相比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）；在宮頸癌組中的表達(dá)與慢性宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見表 2。

2.2 Maspin、bFGF 蛋白在 HPV（-）CIN 組中的表達(dá)情況

2.2.1 Maspin蛋白在HPV（-）CIN組中的CINⅠ級組、CINⅡ級組、CINⅢ級組的陽性率逐漸下降，但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表2 bFGF蛋白在高危型HPV（+）宮頸組織中的表達(dá)Tab 2 The expression of bFGF in high-risk type HPV+cervical carcinoma

表3 Maspin蛋白在HPV（-）宮頸組織中的表達(dá)Tab 3 The expression of Maspin protein in HPV-cervical carcinoma

2.2.2 bFGF在HPV（-）CIN組中的CINⅠ級組、CINⅡ級組、CINⅢ級組的陽性率逐漸升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 4。

表4 bFGF在HPV（-）宮頸組織中的表達(dá)Tab 4 The expression of bFGF in HPV-cervical carcinoma

2.3 Maspin、bFGF表達(dá)與高危型HPV的相關(guān)性分析 在CIN組中，Maspin蛋白的表達(dá)與高危型HPV呈負(fù)相關(guān)（r=-0.205，P=0.024）；bFGF 蛋白的表達(dá)與高危型HPV呈正相關(guān)（r=0.189，P=0.038）。在高危型HPV（+）的宮頸病變組織中，Maspin與bFGF的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.325，P<0.001）。

3 討論

3.1 Maspin、bFGF蛋白與宮頸病變的關(guān)系及兩者的相關(guān)性 Maspin是1994年Zou等[1]用消減雜交技術(shù)從正常乳腺上皮細(xì)胞中分離出的一種新基因，定位于染色體18q21.3-q23屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin超家族的成員之一。不同組織定位不同，可以表達(dá)在細(xì)胞核和（或）細(xì)胞漿，因該蛋白具有穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)，因此可通過免疫組化的方法檢測。有研究表明，Maspin不僅具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的功能，降低腫瘤細(xì)胞活性，減弱癌細(xì)胞侵蝕活性及轉(zhuǎn)移能力，還作為有效血管生成的抑制因子，其通過改變細(xì)胞表面黏合素結(jié)構(gòu)或直接減少微血管數(shù)量誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種途徑發(fā)揮抑癌作用[2-3]。國外有關(guān)Maspin在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌等的研究[4-7]充分證明了Maspin在腫瘤發(fā)生中所起到的重要作用。有研究結(jié)果提示宮頸癌Maspin表達(dá)與臨床分期、腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且隨訪發(fā)現(xiàn)Maspin陰性組和陽性組生存狀況也有明顯差異[8]，故Maspin的檢測可能有助于對宮頸癌惡性程度和預(yù)后的評估和預(yù)測；但其在CIN組及與HR-HPV的相關(guān)性研究國內(nèi)外報(bào)道甚少。本研究檢測Maspin在高危型HPV（+）的慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌5個(gè)組別中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Maspin的表達(dá)隨著宮頸病變由慢性宮頸炎→CIN→宮頸癌的發(fā)展而依次下降，推測Maspin作為腫瘤抑制基因，在CIN及宮頸癌的發(fā)生中抑制癌變的發(fā)展。當(dāng)發(fā)展至CINⅢ及宮頸癌，Maspin的表達(dá)同慢性宮頸炎組、CINⅠ級組、CINⅡ級組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這一結(jié)果與Xu等[9]在宮頸癌中的研究結(jié)果一致，因此，若高級別CIN中Maspin的表達(dá)強(qiáng)度減弱，提示這些病變更具有發(fā)展為宮頸癌的可能，即Maspin在宮頸病變由高級別CIN到原位癌甚至到浸潤癌的惡性進(jìn)展過程中有重要作用。

bFGF作為一種細(xì)胞絲裂原和促血管生長因子在體內(nèi)分布廣泛，但都是微量表達(dá)，而在多種腫瘤細(xì)胞中明顯高表達(dá)。bFGF基因可產(chǎn)生多種異構(gòu)體,在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、胞膜中皆有表達(dá)，存在于細(xì)胞質(zhì)中的bFGF是血管生成因子，以自分泌或旁分泌方式參與腫瘤間質(zhì)血管生成的調(diào)節(jié),促進(jìn)細(xì)胞遷移、有絲分裂和增殖，參與腫瘤發(fā)生、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種過程。還有研究結(jié)果顯示：bFGF與腫瘤病理分級、分期正相關(guān)，并與預(yù)后負(fù)相關(guān),這在宮頸癌[10]中也得到證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)檢測bFGF在高危型HPV（+）的慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌5個(gè)組別中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示bFGF的表達(dá)隨宮頸病變由慢性宮頸炎→CIN→宮頸癌的發(fā)展而依次上升，雖慢性宮頸炎組、CINⅠ級組、CINⅡ級組之間無顯著性差異，但慢性宮頸炎組與CINⅢ組、宮頸癌組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測bFGF可能在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。故bFGF的檢測可了解宮頸病變的進(jìn)展并可能有助于對宮頸癌惡性程度和預(yù)后的評估和預(yù)測。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在高危型HPV（+）的宮頸病變組織中，Maspin、bFGF蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，2007年王東林等[11]在膠質(zhì)瘤的研究中也報(bào)道過兩者的負(fù)相關(guān)關(guān)系，故推測在宮頸病變的發(fā)展過程中，Maspin表達(dá)減少在一定程度上導(dǎo)致bFGF表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)宮頸病變中腫瘤血管的形成，從而進(jìn)一步促進(jìn)浸潤和轉(zhuǎn)移。

3.2 高危型HPV與Maspin、bFGF的相關(guān)性 高危型HPV感染與宮頸癌高度相關(guān)，以往研究認(rèn)為高危型HPV E6原癌蛋白是高危型HPV的主要轉(zhuǎn)化蛋白，此原癌蛋白主要是通過P53與泛素連接酶E6-AP形成復(fù)合物，使P53泛素化分解而失去對細(xì)胞生長負(fù)調(diào)節(jié)的功能，從而引起細(xì)胞無限增生并向惡性轉(zhuǎn)化[12]。

體外研究發(fā)現(xiàn)Maspin表達(dá)受野生型p53的直接調(diào)控，p53與Maspin啟動(dòng)子上特異位點(diǎn)結(jié)合，激活Maspin基因啟動(dòng)子，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性。本研究通過檢測Maspin在高危型HPV陽性、HPV陰性的CIN組中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Maspin的表達(dá)與高危型HPV的感染呈負(fù)相關(guān)（r=-0.205，P=0.024）；且在HPV（-）的CIN組中Maspin蛋白3組間表達(dá)率雖然依次降低，但3組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在高危型HPV（+）CINⅢ組中Maspin的表達(dá)明顯低于CINⅠ、CINⅡ級組。Li等[13]研究證實(shí)高危型HPV感染隨宮頸病變惡性程度而逐漸升高，其中，高危型HPV16 DNA同CINⅢ級、宮頸癌整合率（35.7%，58.1%）遠(yuǎn)高于 CINⅠ級、CINⅡ級（16.7%，18.8%），考慮Maspin蛋白在CINⅢ級及宮頸癌表達(dá)銳減可能同高危型HPV整合至細(xì)胞遺傳基因中通過P53通路下調(diào)Maspin蛋白所致，從而促進(jìn)宮頸病變由CIN向?qū)m頸癌的進(jìn)展。

Bernal等[14]對人膠質(zhì)瘤和肝癌細(xì)胞培養(yǎng)所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變型p53通過bFGF參與腫瘤的血管形成。本研究檢測bFGF在高危型HPV陽性、HPV陰性的CIN組中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)bFGF的表達(dá)與高危型HPV的感染呈正相關(guān)（r=0.189，P=0.038）。

因此，高危型HPV可能通過P53調(diào)節(jié)通路下調(diào)Maspin的蛋白表達(dá)及上調(diào)bFGF的蛋白表達(dá)促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生和進(jìn)展；Maspin表達(dá)下降同bFGF上調(diào)有著密切關(guān)系。隨著對宮頸病變研究的深入，Maspin及bFGF聯(lián)合檢測有可能成為觀察宮頸CIN進(jìn)展及預(yù)后評價(jià)的有效指標(biāo)，可能成為宮頸癌臨床基因治療新的分子靶點(diǎn)，但實(shí)際工作中還有很多問題有待進(jìn)一步的研究和積累。

［1］Zou Z,Anisowicz A,Hendfix M J,et a1.Maspin,aserpin with tumor-suppressing activity in human mammary epithelial cells[J].Science,1994,263(5146):526

［2］Zhang B,Huang T,Liu K,et al.Effects of 5-Aza-CdR on cell proliferation of breast cancer cell line MDA-MB-435S and expression of maspin gene[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2007,27(5):543

［3］Kashima K,Ohike N,Mukai S,et al.Expression of the tumor suppressor gene maspin and its significance in intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2008,7(1):86

［4］Bhattacharyya M,Girish G V,Ghosh R,et al.Acetyl salicylic acid(aspirin)improves synthesis of maspin and lowers incidence of metastasis in breast cancer patients[corrected][J].Cancer Sci,2010,101(10):2105

［5］Sharma G,Mirza S,Parshad R,et al.Clinical significance of Maspin promoter methylation and loss of its protein expression in invasive ductal breast carcinoma:correlation with VEGF-A and MTA1 expression[J].Tumour Biol,2011,32(1):23

［6］Turunc T,Bal N,Dirim A,et al.Maspin expression in renal cell carcinoma and its correlation with clinicopathologic parameters[J].Urology,2010,76(3):765

［7］Sopel M,Surowiak P,Berdowska I.Nuclear maspin expression as a good prognostic factor in human epithelial ovarian carcinoma[J].Folia Morphol(Warsz),2010,69(4):204

［8］方世蘭，嚴(yán)倩，張永欣，等.Maspin與p53在宮頸鱗癌中的表達(dá)及相關(guān)性分析[J].中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2009，10(5):377

［9］Xu C,Quddus M R,Sung C J,et al.Maspin expression in CIN 3,microinvasive squamous cell carcinoma,and invasive squamous cell carcinoma of the uterine cervix[J].Mod Pathol,2005,18(8):1102

［10］Luo C F,Hong H L,Lu Y L,et al.Expressions of bFGF and PTEN in cervical carcinoma and their clinical significance[J].Zhonghua Zhong Liu Za Zhi,2010,32(7):533

［11］王東林，王艷芬，施公勝，等.膠質(zhì)瘤中hTERT、maspin和bFGF表達(dá)的相關(guān)性及意義[J].癌癥，2007，26(6)：601

［12］田小英.P53基因突變與HPV相關(guān)宮頸癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2007，15(1):122

［13］Li W,Wang W,Si M,et al.The physical state of HPV16 infection and its clinical significance in cancer precursor lesion and cervical carcinoma[J].J Cancer Res Clin Oncol,2008,134(12):1355

［14］Bernal J A,Iuna R,Espina A,et a1.Human securin interacts with p53 and modulates p53-mediated transcriptional activity and apoptosis[J].Nat Genet,2002,32（2）：306