珍菊降壓片微生物限度檢查方法的驗(yàn)證

姚 萍 江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校 （徐州221116）

珍菊降壓片由野菊花膏粉，珍珠母粉，鹽酸可樂定，氫氯噻嗪，蘆丁組成。是降壓藥中的一種，用于高血壓癥。

微生物限度檢查法主要是指檢查非規(guī)定制劑和其原、輔料受微生物污染程度的一種方法，其具體的檢查項(xiàng)目主要包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)以及控制菌的檢查。每個(gè)具有抑菌作用的藥品的抑菌效果不同，所以適合各個(gè)藥品的微生物限度檢查法也不相同?！吨袊幍洹?010年版中明確的規(guī)定，所有的藥品在進(jìn)行微生物限度的檢查之前必須對(duì)其檢查的主要方法進(jìn)行科學(xué)的驗(yàn)證，以確認(rèn)供試品所采用的檢查方法沒有抑菌作用之后才能夠?qū)ζ溥M(jìn)行檢查，只有這樣，才能夠真實(shí)的反映出供試品所受到污染的具體程度。本研究采用常規(guī)法對(duì)珍菊降壓片的微生物限度檢查進(jìn)行了科學(xué)的方法學(xué)驗(yàn)證，以最大限度的確保該微生物限度檢查方法的有效性，為更好地控制本制劑的質(zhì)量提供科學(xué)的依據(jù)和方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1 培養(yǎng)基 運(yùn)用批號(hào)為090919的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)為090606的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)為090528的膽鹽乳糖培養(yǎng)基，批號(hào)為090111的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，批號(hào)為090413的pH值為7.0的無菌氫氧化鈉－蛋白胨緩沖液，批號(hào)為090408的改良馬丁培養(yǎng)基，MUG培養(yǎng)基（批號(hào)091008），膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（批號(hào)09218），均為中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 運(yùn)用吳江市金家壩醫(yī)藥凈化設(shè)備廠所生產(chǎn)的醫(yī)用凈化工作臺(tái)，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠所生產(chǎn)的電熱恒溫培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠所生產(chǎn)的生化培養(yǎng)箱，天津?qū)嶒?yàn)儀器廠所生產(chǎn)的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，以及上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠所生產(chǎn)的立式壓力蒸汽滅菌器等。高壓蒸汽滅菌鍋、天平、凈化間、凈化工作臺(tái)、恒溫生化培養(yǎng)箱過濾器。

1.3 菌種 本項(xiàng)研究的菌種主要為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠球菌以及黑曲霉等，所有的研究菌種均是由中國藥品生物制品檢定所提供的。

1.4 樣品 珍菊降壓片（批號(hào)101201，常熟華葆制藥有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 菌液的制備 首先，將本項(xiàng)研究的主要菌種，包括金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌等的新鮮培養(yǎng)物接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，以30～35℃的溫度培養(yǎng)18～24h之后，運(yùn)用0.9%無菌氯化鈉溶液，將各菌種分別置于溶液中進(jìn)行10倍系列的稀釋，之后將其制成50～100cfu·mL－1的菌懸液。其次，將白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種在改良的馬丁瓊脂培養(yǎng)基之中，并以23～28℃的溫度來對(duì)于進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)24～48h之后，運(yùn)用用0.9%無菌氯化鈉溶液將其制成50～100cfu·mL－1的菌懸液。第三，將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接到改良的馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基之中，并以23～28℃的溫度來對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)5～7d，之后，當(dāng)大量孢子產(chǎn)生后，加入0.9%無菌氯化鈉溶液3～5mL，將孢子洗脫。接下來，吸出孢子懸液，并將吸出孢子懸液放置于無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液將其制成50～100CFU的孢子懸液。

2.2 供試品溶液的制備 從兩個(gè)不同包裝單位中各取本品5g（共10g），加pH 7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100mL，用勻漿儀攪勻，制成1∶10均勻供試液。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)的驗(yàn)證（平皿法）

2.3.1.1 試驗(yàn)組：取2.2項(xiàng)下所制備出來的的供試液1mL以及菌懸液1mL，并將其共同注入到1個(gè)滅菌平皿中，之后，將其迅速的倒入15～20mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，平行制備兩個(gè)平皿，待凝。分別制作含金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢菌、白色念珠菌的試驗(yàn)組，細(xì)菌在30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；霉菌和酵母菌在23～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。取均值。

2.3.1.2 菌液組：取金黃色葡萄球菌菌懸液、大腸埃希菌菌懸液、枯草芽孢桿菌菌懸液，并將其分別注入到2個(gè)平皿之中，之后立即將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注其中，并將其置于30～35℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，以24～48h的時(shí)間來計(jì)數(shù)。

取含菌量為50～100cfu的白色念珠菌菌懸液，分別注入2個(gè)平皿，置于23～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72h計(jì)數(shù)。

2.3.1.3 供試品對(duì)照組

取1∶10供試液1mL加入到平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2平皿，置于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h計(jì)數(shù)；

取1∶10供試液1mL加入到平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2平皿，置于23～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72h計(jì)數(shù)。

2.3.2 細(xì)菌菌落總數(shù)計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證（采用培養(yǎng)基稀釋法）

2.3.2.1 試驗(yàn)組：將比例為1∶10供試液0.5mL以及含菌量為50～100cfu的金黃色葡萄球菌懸液分別注入平皿之中，然后，立即將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注其中，應(yīng)該為其平行制備4個(gè)平皿，并將其置于30～35℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h計(jì)數(shù)。

2.3.2.2 菌液組：用含菌量為50～100cfu的金黃色葡萄球菌菌懸液分別注入到2個(gè)平皿之后，之后，立即將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注其中，并將其置于30～35℃培養(yǎng)箱中，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)24～48h計(jì)數(shù)。

2.3.2.3 供試品對(duì)照組：將1：10比例的供試液1mL加入到平皿之中，之后，立即將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注其中，再平行制備2個(gè)平皿，并將其置于30～35℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行為期24～48h的培養(yǎng)。

將比例為1∶10的供試液1mL加入到平皿之中，之后，立即將玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基傾注其中，平行制備2個(gè)平皿，并將其置于23～28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72h計(jì)數(shù)。

2.4 控制菌檢查方法驗(yàn)證

2.4.1 菌液制備的主要方法：將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等的新鮮培養(yǎng)物接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基之中，并以30～35℃的溫度來對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)的具體時(shí)間為18～24h，之后，將0·9%無菌氯化鈉溶液注入到各菌種之中，再運(yùn)用10倍系列將其稀釋之后，最終制成50～100cfu·mL－1的菌懸液。

2.4.2 供試品操作過程：從兩個(gè)不同包裝的供試品單位中量取各5g（共10g）的樣品，并將其加入到pH值為7.0的氯化鈉－蛋白胨緩沖液100mL中，運(yùn)用勻漿儀進(jìn)行攪勻，并最終將其制成比例為1∶10的均勻供試液。

2.4.3 試驗(yàn)組：取1∶10供試液10mL及50～100cfu·mL－1的大腸埃希菌菌液接種至100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基，置于35～37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。

2.4.4 陰性菌對(duì)照組：取1∶10供試液10mL及50～100 cfu·mL－1的大腸埃希菌菌液接種至100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基，置于35～37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。

2.4.5 MUG檢查：取0.2mL的上述培養(yǎng)物，病將其接種到含5mLMUG培養(yǎng)基的試管之內(nèi)，在35～37℃溫度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)的5h，24小時(shí)在366nm紫外線下對(duì)其培養(yǎng)的過程進(jìn)行細(xì)致的觀察。觀察之后，兩試管各加入靛基質(zhì)試劑數(shù)滴。

2.5 大腸菌群檢查方法驗(yàn)證

2.5.1 試驗(yàn)組：取1∶10供試液1mL及10～100cfu的大腸埃希菌菌液接種至10mL膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，置于35～37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。

2.5.2 陰性菌對(duì)照組：取1∶10供試液1mL及10～100 cfu的金黃色葡萄球菌菌液接種至10mL膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，置于35～37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 珍菊降壓片微生物限度檢查方法相關(guān)的試驗(yàn)結(jié)果為細(xì)菌計(jì)數(shù)，其主要采用藥典附錄上所進(jìn)行的培養(yǎng)基稀釋法；而霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)則采用的是藥典附錄中的平皿法，控制菌檢查所采用的是藥典附錄中所提及的控制菌檢查方法。

3.1 試驗(yàn)組菌回收率 試驗(yàn)組菌回收率＝（試驗(yàn)組菌落數(shù)－供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液組菌落數(shù)×100%，見下表。

表1 各組試驗(yàn)組菌回收率

由上表數(shù)據(jù)可知，大腸埃希菌試驗(yàn)組的平均回收率為89.3%，枯草芽孢桿菌試驗(yàn)組的平均回收率為87.9%，白色念珠菌試驗(yàn)組的平均回收率為79%，而黑曲霉試驗(yàn)組的平均回收率則為86.7%，可知本品對(duì)大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉無抑菌作用；金黃色葡萄球菌試驗(yàn)組平均回收率為59.3%，可知本品對(duì)金黃色葡萄球菌有一定的抑菌活性。

由此說明本品可以按照平皿法哎進(jìn)行霉菌、酵母菌總數(shù)菌落計(jì)數(shù)；而不可以按照平皿法哎進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)。

3.2 金黃色葡萄球菌回收率計(jì)算方法同上，見表2

表2 各組金黃色葡萄球菌回收率

本品按照培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證，金黃色葡萄球菌試驗(yàn)組的平均回收率為88.6%，說明本品可以按照培養(yǎng)基稀釋法來進(jìn)行細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)。

3.3 試驗(yàn)組MUG陽性，靛基質(zhì)陽性，判檢出相應(yīng)的大腸埃希菌。陰性菌對(duì)照 MUG陰性，靛基質(zhì)陰性，判未檢出任何的大腸埃希菌。

3.4 試驗(yàn)組膽鹽乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陰性菌對(duì)照組膽鹽乳糖發(fā)酵管未產(chǎn)酸產(chǎn)氣，將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種與曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24h。試驗(yàn)組平板上見典型大腸埃希菌菌落生長，陰性菌對(duì)照組平板上未見菌落生長。

試驗(yàn)組的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管呈陽性結(jié)果，在EMB平板上見典型大腸埃希菌菌落，判檢出大腸菌群。陰性菌對(duì)照組的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管呈陰性結(jié)果，判未檢出大腸菌群。

4 討 論 由于珍菊降壓片是一種含有多種成分的復(fù)方中成藥制劑，該項(xiàng)藥物中的任何具有抑菌作用的相關(guān)成分均可以對(duì)微生物限度檢查的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。以本品細(xì)菌計(jì)數(shù)常規(guī)法的結(jié)果為主要的依據(jù)，必須采取其他的有關(guān)試驗(yàn)方法來去除藥物的抑菌作用才能夠較為真實(shí)的反映出該項(xiàng)藥物的受污染程度。本項(xiàng)研究所運(yùn)用的培養(yǎng)基稀釋法可以較為顯著的提高菌落的檢出率。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)表面，珍菊降壓片對(duì)白色念珠菌和黑曲霉均無較為明顯的抑菌作用，所以，霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)通常都會(huì)采用常規(guī)法。此外，珍菊降壓片對(duì)大腸埃希菌也無明顯的抑菌作用，控制菌檢查陽性對(duì)照組生長狀況良好，陰性菌對(duì)照組則沒有檢出，所以，其控制菌檢查所采用的同樣是常規(guī)法。

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[2]陳華龍，王莉培，譚莉萍.姜膽咳喘片微生物限度檢查方法的驗(yàn)證[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（11）：67.