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    樺褐孔菌粗多糖的精制方法探討

    2012-07-05 03:51:18韓耀玲徐騰飛賈中祥楊春鵬史順水
    河南大學學報(醫(yī)學版) 2012年3期
    關鍵詞:馬斯亮孔菌氯乙酸

    韓耀玲,徐騰飛,賈中祥,楊春鵬,劉 洋,史順水,韓 光

    (河南大學藥學院 天然藥物化學教研室,河南 開封 475004)

    樺褐孔菌(Inonotus obliquus)為多孔菌科的藥用真菌,在我國的黑龍江、吉林兩省資源較為豐富,民間廣泛用于治療一些惡性腫瘤[1]。對于樺褐孔菌的化學成分及生物活性研究已證實其具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、降血脂及保肝等廣泛的藥理作用[2-13]。已有的報道多集中于羊毛脂烷型四環(huán)三萜類等小分子次生代謝產物的分離及相應的生物活性研究,并取得顯著的研究成果,發(fā)現(xiàn)不少活性化合物。樺褐孔菌原藥材中總三萜(醇提物)約占4.5%,較之多糖(最高可達14.1%)而言尚為少量[14],而含量頗豐的多糖在樺褐孔菌的藥效發(fā)揮中是否具有重要作用也是意義重大的研究,故近年陸續(xù)出現(xiàn)了樺褐孔菌粗多糖抗氧化、抗腫瘤、降血脂等藥理作用的相關報道[15-17]。

    對于粗多糖的提取多為傳統(tǒng)的水提醇沉法,所得多糖產物中多含蛋白質、色素、無機離子等雜質,而其中蛋白質對于多糖的結構和活性研究的干擾是最大的,故對粗多糖的除蛋白效果就顯得尤為重要,在此前提下,我們以多糖保留率和蛋白去除率為雙重指標,對Sevag法、三氯乙酸法和酶法等常用的除蛋白方法進行了研究評價。

    1 儀器與試劑

    RE52-05旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);UV-1600型分光光度計(北京瑞利分析儀器公司);電子天平(上海精科實業(yè)有限公司);胃蛋白酶(1∶10000);考馬斯亮藍為生化試劑;硫酸、蒽酮、氯仿、正丁醇和三氯乙酸均為分析純。

    2 實驗方法

    2.1 粗多糖的提取

    取樺褐孔菌干燥子實體1kg,粉碎,體積分數95%的乙醇回流提取3次,1h/次,取藥渣,加10倍量的水,沸水提取3次,提取時間分別為60、40、30min,將提取液合并后減壓濃縮至2L,緩緩加入無水乙醇至含醇量為75%,靜置過夜,抽濾,并將沉淀依次用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌,真空干燥10h,得樺褐孔菌粗多糖81g;將粗多糖配制成體積分數1%的水溶液,并依次用Sevag法、三氯乙酸法和酶法進行除蛋白處理,并對其精制效果進行比較和評價。

    2.2 粗多糖的精制(除蛋白)

    Sevag法:將氯仿與正丁醇4∶1混合,配成Sevag試劑,加入多糖水溶液(多糖水溶液/Sevag試劑為4∶1),劇烈振搖20min,2000r/min離心10min,分取水層(上層);將水層如此反復除蛋白6次,即得Sevag法除蛋白的多糖水溶液。

    三氯乙酸法:將三氯乙酸加水配制成0.5mol/L,加入多糖水溶液(多糖水溶液/三氯乙酸溶液為20∶3),劇烈振搖20min,靜置40min,2000r/min離心10min,取上清液即得三氯乙酸法除蛋白的多糖水溶液。

    酶法:將胃蛋白酶加入多糖水溶液,加入量為1∶200(mL∶U),30℃水浴,酶解2h,沸水浴5min,對酶進行滅活,冷卻至室溫,2000r/min離心10min,取上清液即得酶法除蛋白的多糖水溶液。

    2.3 測定多糖與蛋白的含量

    測定溶液的配制:精密稱取蒽酮100mg,溶解于體積分數80%硫酸溶液100mL中,配制成硫酸-蒽酮溶液;精密稱取考馬斯亮藍G-250100mg,分別加入體積分數95%乙醇50mL和體積分數85%磷酸100mL溶解,最后用蒸餾水定容至1000mL,配制成考馬斯亮藍溶液。

    硫酸-蒽酮法測定多糖:取粗多糖水溶液和除蛋白的多糖水溶液加10倍量的水進行稀釋,取2mL,加入硫酸-蒽酮溶液6mL,混勻,沸水浴15min,冰浴15min,于625nm處測定其吸光度。

    考馬斯亮藍法測定蛋白:取粗多糖水溶液和除蛋白的多糖水溶液加10倍量的水進行稀釋,取1mL,加入考馬斯亮藍溶液5mL,混勻,放置10min,于595nm處測定其吸光度。

    3 結果與討論

    按照“2.3”操作方法分別將Sevag法、三氯乙酸法和酶法除蛋白后的多糖水溶液進行多糖與蛋白的含量測定,重復實驗6次。測定結果表明,Sevag法的多糖保留率較高(72.9%),多糖損失較小,但蛋白去除率最低(9.5%),對粗多糖的精制效果不佳;三氯乙酸法一次性可除去96.0%的蛋白質雜質,精制效果較好,但多糖保留率僅為13.3%,損失嚴重;酶法的多糖保留率為46.9%,蛋白去除率為43.8%,見表1、圖1。

    實驗結果表明,對于樺褐孔菌多糖而言,Sevag法、三氯乙酸法和酶法均不能同時保持較高的多糖保留率和蛋白去除率,故均不是最佳的除蛋白方法。經綜合分析,Sevag法的多糖保留率較高,多糖損失較小,而三氯乙酸法則具有最高的蛋白去除率,故在實際操作中可考慮將Sevag法和三氯乙酸法結合起來應用,以同時保持較高的多糖保留率和蛋白去除率,達到較好的精制效果。

    表1 Sevag法、三氯乙酸法和酶法的除蛋白結果比較

    圖1 粗多糖溶液與3種方法除蛋白后水溶液多糖和蛋白測定結果圖

    有文獻[18]報道,樺褐孔菌胞外多糖最佳的脫蛋白工藝為三氯乙酸法,其蛋白質去除率為68.5%,多糖損失率僅為2.45%。樺褐孔菌胞外多糖乃菌絲體培養(yǎng)液中存在的多糖,而培養(yǎng)液又為水溶液,與樺褐孔菌細胞內的環(huán)境有所不同,可能會使其多糖結構有所相同。我們實驗結果與文獻報道的樺褐孔菌胞外多糖的脫蛋白工藝結果不符,也進一步說明樺褐孔菌多糖與人工培養(yǎng)的菌絲體胞外多糖的結構中載蛋白情況可能不同,其藥理作用也可能不盡相同(因結構決定活性),而這些均有待于進一步的實驗研究。

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