大蒜和生姜提取物體外聯(lián)合抑菌效果的研究

陳 映，楊夏雨，浦淑林，周 超，張 雷

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

大蒜和生姜均屬于天然食用香辛料，是一類含有各種揮發(fā)性香氣成分，能賦予食品香味的一類天然物質(zhì)。他們除具有增香作用外，還含有多種營養(yǎng)成分和藥用價(jià)值，其抗菌作用可被用作保鮮液和防腐劑〔1〕。隨著化學(xué)防腐劑的安全性受到挑戰(zhàn)，尋求天然食品防腐劑已引起人們的極大重視。為滿足各種保健食品、綠色食品生產(chǎn)的需求，開發(fā)廣譜、高效、安全、低廉且抑菌性能較好的天然防腐劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義〔2〕。本文通過對大蒜和生姜兩種提取物的總活性成分進(jìn)行數(shù)種代表菌的抑菌效果研究，為其作為藥物臨床應(yīng)用或作為食品添加劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株、試劑和主要儀器標(biāo)準(zhǔn)菌株為金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、大腸桿菌（ATCC 25922）和白色念珠菌（ATCC 90029）；臨床分離耐藥株：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（1420）和耐β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌（1616）均由大理學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)。

大蒜由大理菜市場購買；生姜提取物（生姜精油ZXX1001，超臨界CO2萃取工藝生產(chǎn)）由鄭州雪麥龍惠贈(zèng)。營養(yǎng)瓊脂（批號(hào)：111007）、MH瓊脂（批號(hào)：20021101）、MH肉湯（批號(hào)：20020903）和沙保弱培養(yǎng)基（批號(hào)：20070227）等均由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。

恒溫水浴箱（上海一恒科技，DKB-600B）、低速平衡離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠，LDZ5-2）、立式高壓滅菌器（上海博訊，YXQ－LS－50S）、生化培養(yǎng)箱（常州偉嘉儀器，WJ-250B）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海藍(lán)旭，RE-2000）。

1.2大蒜提取物供試樣品的制備稱取50 g大蒜洗凈去皮，搗碎，在40℃下存放讓其自身酵解30 min后，按料液比1∶4的比例加入95%乙醇，在35 ℃下萃取90 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液在壓強(qiáng)為0.015 MPa，75 r/min下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮30 min去除乙醇，用濾紙過濾，再用0.2 μm微孔濾膜過濾定容至25 mL，即得到相當(dāng)于2 g原料的提取物/mL的供試樣品原液〔3-5〕。

1.3藥物紙片制備將直徑為6.35 mm的圓形濾紙片，吸水量為20 μL，放入EP管中121℃下滅菌30 min，按每片圓形濾紙片加20 μL稀釋為0.7 g/mL的大蒜提取物原液，制成含大蒜提取物原液14 mg的濾紙片。同法制備含生姜提取液的藥物濾紙片〔6〕。

1.4體外抑菌試驗(yàn)制備0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，以K-B法〔6〕分別檢測大蒜和生姜提取物對標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 25923、ATCC 25922和ATCC 90029以及臨床分離株1420和1616的抑菌作用。

1.5最低抑菌濃度測定以宏量稀釋法〔6-7〕分別檢測大蒜和生姜提取物對ATCC 25923、1420和ATCC 90029的最低抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）。37 ℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，以完全抑制細(xì)菌生長的最低提取物濃度為其MIC。

1.6聯(lián)合抑菌試驗(yàn)以微量法檢測大蒜和生姜提取物對ATCC 25923、1420和ATCC 90029的聯(lián)合抑菌效果。用無菌的96孔板，在第1～6行沿X軸方向（從左到右）每孔中依次加入普通肉湯、1/2倍的MIC、1倍的MIC、2倍的MIC、4倍的MIC、8倍的MIC的大蒜提取物各25 μL，以同樣的方法在第A～F列沿Y軸方向（從上到下）每孔中依次加入8倍的MIC、4倍的MIC、2倍的MIC、1倍的MIC、1/2倍的MIC的生姜提取物和普通肉湯各25 μL，加入制備好的0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液50 μL，蓋上消毒玻板，振蕩混勻，放入墊有濕紗布的方盤內(nèi)，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果，計(jì)算部分抑菌（Fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）指數(shù)。FIC指數(shù)＝大蒜提取物聯(lián)用時(shí)MIC/大蒜提取物單用時(shí)MIC+生姜提取物聯(lián)用時(shí)MIC/生姜提取物單用時(shí)MIC。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用；0.5～1為相加作用；1～2為無關(guān)作用；＞2為拮抗作用〔6-8〕。

2 結(jié)果

2.1 K-B法檢測體外抑菌作用的結(jié)果與分析通過t檢驗(yàn)分析表明：大蒜提取物對各實(shí)驗(yàn)菌株的抑菌作用均強(qiáng)于生姜提取物，其差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，大蒜和生姜提取物對同一菌株的抑菌作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；大蒜提取物對實(shí)驗(yàn)菌株的抑菌作用由強(qiáng)到弱依次為：ATCC 90029，1420，ATCC 25923，ATCC 25922，1616，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；生姜提取物對實(shí)驗(yàn)菌株的抑菌作用由強(qiáng)到弱依次為：ATCC 25923，ATCC 25922，1616，ATCC 90029，1420，其差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 大蒜和生姜提取物抑菌效果的比較

2.2最低抑菌濃度檢測結(jié)果大蒜提取物對ATCC 25923、1420和ATCC 90029的MIC均小于生姜提取物。見表2。

2.3微量稀釋法檢測大蒜和生姜提取物聯(lián)合抑菌效果與分析大蒜提取物與生姜提取物對ATCC 25923的FIC為1.125，其聯(lián)合抑菌效果為無關(guān)作用，大蒜提取物與生姜提取物對1420的FIC為0.375，其聯(lián)合抑菌效果為協(xié)同作用，大蒜提取物與生姜提取物對ATCC 90029的FIC為0.625，其聯(lián)合抑菌效果為相加作用。

表2 大蒜提取物與生姜提取物的MIC

3 討論

大蒜是一種藥食同源的食物，大蒜具有抑菌、殺菌、殺病毒和提高免疫力等功效〔9〕，其主要的功能性成分是大蒜新素、大蒜辣素、蒜氨酸、蒜酶、超氧化物歧化酶〔10〕。生姜具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤、抗缺氧、抗病原體、抗?jié)兒透纳凭植垦貉h(huán)等藥理作用〔11〕，生姜的抗菌成分主要是姜黃素和揮發(fā)油，姜黃素不但可以調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞的活性，還可以抑制病毒、真菌、細(xì)菌〔12〕。王琣等的研究也發(fā)現(xiàn)大蒜、生姜復(fù)配提取液的抑菌效果優(yōu)于苯甲酸鈉，用復(fù)配提取液浸泡果蔬后可延長貨架期，復(fù)配提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉和啤酒酵母菌的抑菌作用均強(qiáng)于其單一提取液〔13〕。

本研究選用耐甲氧西林金黃色葡萄球菌臨床分離株（1420）和非耐藥金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25923）作為革蘭陽性菌的代表，選用耐β-內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌臨床分離株（1616）和非耐藥的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25922）作為革蘭陰性菌的代表，選用白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 90029）作為真菌的代表，研究結(jié)果表明：大蒜和生姜的提取物對實(shí)驗(yàn)中的革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌均有抑菌活性，對耐藥細(xì)菌也有很好的抑菌活性；大蒜提取物對實(shí)驗(yàn)中的革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌的抑菌效果都優(yōu)于生姜提取物，它們抑菌作用的不同主要是由于其不同的抗菌成分所造成的。而且大蒜與生姜提取物聯(lián)合使用時(shí)，可增強(qiáng)對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌1420和白色念珠菌ATCC 90029的抑菌效果，從而減少藥物用量，節(jié)約成本。在聯(lián)合抑菌試驗(yàn)中，并未發(fā)現(xiàn)大蒜和生姜的提取物對實(shí)驗(yàn)菌株有拮抗效應(yīng)，這與王琣等對大蒜和生姜復(fù)配液抑菌效果的研究結(jié)果是一致的〔13〕。本研究通過FIC指數(shù)的測算，明確了大蒜和生姜復(fù)配提取液對各實(shí)驗(yàn)菌株的聯(lián)合抑菌效果，為大蒜和生姜抑菌制品的聯(lián)合使用及其在臨床和食品防腐劑的開發(fā)應(yīng)用方面提供了更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室王濤老師、藥學(xué)院有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室李龍星老師和病原生物學(xué)研究生劉蓉華同學(xué)，對本研究給予了大力幫助，謹(jǐn)致謝意。

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