腸毒性大腸埃希菌腸毒素LTa基因特異性EMA－PCR 檢測方法的建立

趙素君，曹 冶，謝 晶，李江凌，王秋實(shí)，葉勇剛，羅丹丹，葉健強(qiáng)，廖黨金

（四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066）

腸毒性大腸埃希菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是幼畜腹瀉的重要病原菌，在臨床上可引起幼畜急性嚴(yán)重腹瀉。該病發(fā)病率高，傳染性強(qiáng)，腸毒素是ETEC的直接致病因子[1－4]。由于PCR技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高和準(zhǔn)確快速等優(yōu)點(diǎn)，腸毒素基因的PCR擴(kuò)增已經(jīng)被越來越多地應(yīng)用于腸毒性大腸埃希菌的檢測[5－8]。但傳統(tǒng)PCR技術(shù)無法區(qū)分樣品中的死細(xì)菌與活細(xì)菌，在活菌DNA和死菌DNA中均能擴(kuò)增出目的基因[9－10]。死菌DNA的存在，也同樣被檢測到，其結(jié)果會(huì)導(dǎo)致過高估計(jì)活菌數(shù)量，并可能在沒有活菌存在的情況下也會(huì)出現(xiàn)陽性檢測結(jié)果（假陽性），從而干擾檢測結(jié)果的真實(shí)性。

疊氮溴乙錠（ethidium monoazide bromide，EMA）是一種熒光插入型核酸結(jié)合染料，能穿過死細(xì)菌的細(xì)胞膜，在光激活的作用下與基因組DNA共價(jià)結(jié)合，從而能抑制樣品中死菌體的DNA擴(kuò)增；而活細(xì)菌因具有完整的細(xì)胞膜而能阻止EMA滲透，使EMA對活菌體的DNA不起作用[11－14]。該技術(shù)在國內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究將EMA與PCR技術(shù)結(jié)合，在PCR擴(kuò)增腸毒素基因目的片段的檢測過程中，通過EMA選擇性地與混合細(xì)菌菌落中的死細(xì)胞DNA共價(jià)結(jié)合，除去死細(xì)菌DNA對PCR擴(kuò)增的干擾，可大大提高檢測的準(zhǔn)確性，以建立一種快速、有效的檢測腸毒性大腸埃希菌活細(xì)菌的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 陽性菌株：腸毒性大腸埃希菌CVCC196、CVCC197、CVCC200；對照菌株：腸出血性大腸埃希菌CVCC248，腸侵襲性大腸埃希菌CVCC2072，腸致病性大腸埃希菌CVCC251，金黃色葡萄球菌CVCC3055、CVCC3056，豬霍亂沙門菌CVCC504，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所中國獸醫(yī)微生物菌種保存管理中心。

1.1.2 主要試劑 EMA為Biotium公司產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL 2000為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；引物合成及核酸測序由Invitrogen公司完成。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中腸毒性大腸埃希菌不耐熱腸毒素基因LTa設(shè)計(jì)引物。引物序列為 F：5′－GCGACAGATTATACCGTGC－3′；R：5′－GGTCTCTATATTCCCTGTT－3′，擴(kuò)增目的條帶大小為438bp。

1.2 方法

1.2.1 腸毒性大腸埃希菌活菌和死菌的制備 接種腸毒性大腸埃希菌，培養(yǎng)16h后，取1mL菌液于EP管中，6000r／min，4℃，離心5min，收集菌體沉淀，加入無菌生理鹽水重懸沉淀，制成活菌懸液。取部分活菌懸液，72℃水浴15min，得到死菌懸液。

1.2.2 EMA處理 取適量菌懸液于EP管中，加入終濃度為100μg／mL的EMA，在黑暗處放置5 min后，于650W鹵素光源光照處理1min，光源放在離樣品管20cm處，光照時(shí)EP管放在冰上，以免樣品溫度過高。EMA處理后的樣品，用于模版DNA的制備。

1.2.3 模版DNA的制備 取1mL菌液，12000 r／min離心5min，去除上清液，用100μL滅菌去離子水重懸，然后于100℃水浴5min后，10000 r／min離心5min，上清液用作PCR檢測。

1.2.4 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化 PCR反應(yīng)體系：10×Ex Taq buffer（含 MgCl2）2.5μL，dNTP mixture（各2.5mmol／L）2μL，引物 F（20 μmol／L）0.5μL，引物 R（20μmol／L）0.5μL，模板DNA 1μL，TaKaRa Ex Taq（5U／μL）0.25μL，滅菌雙蒸水加至25μL。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化主要通過退火溫度來實(shí)現(xiàn)，為了獲得特異性的擴(kuò)增片段，采用Touchdown PCR方法確定PCR反應(yīng)合適的退火溫度，設(shè)定退火溫度范圍65℃～45℃。擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 特異性檢測 用腸毒性大腸埃希菌CVCC196、CVCC197、CVCC200作為陽性菌株，以CVCC248、CVCC2072、CVCC251、CVCC3055、CVCC3056、CVCC504作為陰性對照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，即為檢測陽性，否則為陰性。

1.2.6 靈敏度檢測 接種腸毒性大腸埃希菌CVCC196，培養(yǎng)16h，取1mL菌液于EP管中，遞倍稀釋10－1～10－9，PCR檢測其靈敏度。同時(shí)，采用平板法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，通過牛肉膏蛋白胨瓊脂平板進(jìn)行對照計(jì)數(shù)，分別取遞倍稀釋100～10－9的菌液50μL進(jìn)行涂板，37℃培養(yǎng)過夜，然后分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算檢測靈敏度。

1.2.7 不同活菌比例的混合菌懸液的EMA－PCR擴(kuò)增 分別配制含有1000、750、500、300、200、100、50、40、30、20、10、0mL／L 的腸毒性大腸埃希菌CVCC196活細(xì)胞菌懸液混合體系，分別加入終濃度為100μg／mL的EMA，在黑暗處放置5min后，樣品置于冰上用650W鹵素光源距離20cm處光照處理1min，經(jīng)EMA處理后的菌液，用于如上DNA模版的制備，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.8 EMA－PCR檢測靈敏度的干擾試驗(yàn) 取腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌CVCC196純菌液的活細(xì)胞和死細(xì)胞懸液各250μL，用PBS緩沖液進(jìn)行遞倍稀釋10－1～10－9，分別取50μL進(jìn)行涂板，37℃培養(yǎng)過夜，然后分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算檢測靈敏度。同時(shí)，分別取50μL混入450μL的其他雜菌中，進(jìn)行EMA－PCR檢測，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)過Touchdown PCR方法確定最佳的PCR反應(yīng)條件為：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)大小為438bp的特異性目的條帶（圖1）。

圖1 腸毒性大腸埃希菌PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR results of the enterotoxigenic Escherichia coli

2.2 PCR特異性檢測結(jié)果

PCR特異性檢測結(jié)果見圖2。PCR檢測結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，只有腸毒性大腸埃希菌CVCC196、CVCC197和CVCC200擴(kuò)增出目的條帶，而對照菌株CVCC248、CVCC2072、CVCC251、CVCC3055、CVCC3056和CVCC504未出現(xiàn)特異性條帶。

圖2 PCR檢測的特異性試驗(yàn)Fig.2 The specific test results of PCR

2.3 PCR靈敏度檢測結(jié)果

各梯度稀釋液的PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析（圖3），其靈敏度檢測低限為10－9，而相應(yīng)的平板計(jì)數(shù)為19cfu／mL。

圖3 PCR檢測的靈敏性試驗(yàn)Fig.3 The sensitive test results of PCR

2.4 EMA－PCR區(qū)分死菌與活菌的檢測結(jié)果

EMA－PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示除了全部是死菌的組外，其他含活菌各種比例的混合菌液中，均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。

圖4 EMA－PCR對腸毒性大腸埃希菌活菌／死菌混合物的檢測Fig.4 The detection for live and dead bacteria mixture of ETEC by EMA－PCR

2.5 EMA－PCR檢測靈敏度的干擾試驗(yàn)結(jié)果

模擬混合雜菌液以9∶1的比例對活菌和死菌混合懸液各梯度稀釋液進(jìn)行干擾，EMA－PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖5所示。其靈敏度檢測低限為10－8，而相應(yīng)的平板計(jì)數(shù)為24cfu／mL。結(jié)果表明，模擬混合雜菌的干擾基本沒有影響其檢測的靈敏度。

圖5 EMA－PCR檢測靈敏度的干擾試驗(yàn)Fig.5 Effect on sensitivity of the EMA－PCR detection by interference experiment

3 討論

目前，對ETEC的檢測和鑒定仍然停留在病原分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)等傳統(tǒng)方法的水平上，這些方法雖然確實(shí)可靠，但繁瑣、費(fèi)時(shí)、靈敏性不高。而PCR方法在病原體檢測和鑒定方面不僅敏感、特異，而且簡便、快捷，但常規(guī)PCR技術(shù)無法區(qū)分樣品中的死細(xì)菌與活細(xì)菌，常常因死菌的存在而使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性，干擾檢測的真實(shí)性。

本研究將EMA的選擇滲透性和PCR的特異靈敏性相結(jié)合建立的EMA－PCR方法，可以特異地檢測樣品中的活菌，操作簡單、快速，不需要復(fù)雜的DNA提取步驟，具有很好的特異性和較好的敏感性。該方法的檢測靈敏度達(dá)19cfu／mL，通過模擬混合雜菌液對EMA－PCR檢測靈敏度的干擾試驗(yàn)，結(jié)果顯示檢測靈敏度為24cfu／mL，表明模擬混合雜菌的干擾基本沒有影響其檢測的靈敏度。在本試驗(yàn)中，腸毒性大腸埃希菌細(xì)胞的熱致死條件為72℃水浴15min，Wang S等[15]對創(chuàng)傷弧菌的熱致死條件是100℃作用5min；Nogva H K等[16]對大腸埃希菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌以及沙門菌的致死條件是72℃或者100℃加熱5min，或者使用700 mL／L的異丙醇等致死方法。因此認(rèn)為，不同的活菌細(xì)胞致死方法可能會(huì)影響到所需要的EMA濃度以及EMA結(jié)合效率。EMA－PCR作為一種新型的檢測技術(shù)，能夠有效區(qū)分病原菌的死細(xì)胞與活細(xì)胞，利用該方法可避免因分析的樣品中含有死細(xì)菌而造成的假陽性檢測結(jié)果，檢測的準(zhǔn)確性和真實(shí)性較傳統(tǒng)PCR大大提高。EMA－PCR檢測腸毒性大腸埃希菌活細(xì)菌技術(shù)的建立在病原菌的臨床檢測以及養(yǎng)殖場環(huán)境的監(jiān)測中均具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和良好的應(yīng)用前景。

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