蒲公英內(nèi)生真菌PG23抗癌活性的初步研究

孫新城，李 丹，羅 宇，張慧茹，3＊

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南工業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450001；3.鄭州大學(xué)，河南 鄭州 450001）

藥用植物內(nèi)生真菌（endophytic fungus）是一類自然界中存在的、能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)的新型微生物藥物資源[1－2]。人們發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌與宿主長期共生，也能產(chǎn)生出植物抗癌物質(zhì)，如黃酮類、萜類、生物堿類、多糖、肽類等[2]，因此，研究內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物，從中尋找新型的抗癌、抗病毒、抗氧化的微生物藥物，具有誘人的應(yīng)用前景。

蒲公英是一味清熱解毒類中草藥，具有抗菌[3]、抑癌和抗突變[4]、抗氧化[5]等多種藥理作用，并能提高免疫功能低下小鼠的免疫力[6]。張慧茹等[7]從蒲公英中分離出3株具有抗菌特性的蒲公英內(nèi)生真菌，并對其抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行分析，初步判定為多糖類物質(zhì)[8]，研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英內(nèi)生真菌PG23具有抗菌、消除耐藥質(zhì)粒的生物活性，并且無急性和致死性毒性，其發(fā)酵液主要含有糖類、酚類、有機(jī)酸類等生物活性物質(zhì)[9]。為檢驗蒲公英內(nèi)生真菌PG23多糖類物質(zhì)的抗癌作用，本研究通過PG23發(fā)酵液對A549細(xì)胞的抑制作用，探討其抗癌作用，為其應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

蒲公英內(nèi)生真菌PG23，河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院動物生理實驗室分離并保存；A549細(xì)胞株，購自美國 ATCC細(xì)胞庫；RPMI－1640、胎牛血清（FBS），購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、胰酶，均購自美國Sigma公司；環(huán)磷酰胺（CTX），江蘇恒瑞醫(yī)藥公司生產(chǎn)；葡萄糖，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；0.1g／mL的蒲公英浸汁，自制；豆油、玉米粉、馬鈴薯，均為市售。

1.2 方法

1.2.1 PG23發(fā)酵液的制備及粗多糖的提取 將保存的PG23菌種接馬鈴薯固體培養(yǎng)基平板活化；以馬鈴薯浸出液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，制備種子液；在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加2.6%葡萄糖、0.53%豆油、0.10%玉米粉、7.06%蒲公英浸汁（0.1g／mL）作為發(fā)酵液體培養(yǎng)基，接種10%的種子液，26℃、160r／min發(fā)酵7 d。發(fā)酵液8000r／min離心20min，取上清液1000 mL，950mL／L乙醇沉淀得沉淀物，揮干，稱重計算粗多糖得率，粗多糖得率（%）＝粗多糖克數(shù)／1000×100%。將所得粗多糖溶于500mL無菌水中作為儲備液，4℃貯藏備用。

1.2.2 PG23粗多糖含量的測定 精密稱取已干燥至恒重的葡萄糖0.1g，配制成100μg／mL葡萄糖溶液，準(zhǔn)確量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL葡萄糖溶液加蒸餾水至1.0mL，各管加5g／L的苯酚溶液1.0mL搖勻，再加入5.0mL濃硫酸，沸水浴15 min后冷卻，酶標(biāo)儀測490nm處吸光度值（OD值），以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確量取1.0mL發(fā)酵儲備液，稀釋至200倍，取稀釋液1.0mL，按上述方法操作，于490nm處測吸光值，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算稀釋液中多糖含量，并計算儲備液中多糖含量，多糖含量（%）＝測量得出的稀釋液中多糖含量／沉淀溶解在儲備液中的含量×100%。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549細(xì)胞以5×105個／mL濃度接種于直徑為9cm培養(yǎng)皿中，加入含200 mL／L FBS的 RPMI－1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長近80%融合時，用胰酶消化傳代、擴(kuò)增，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于試驗。

1.2.4 MTT法檢測PG23多糖對肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的增殖抑制率及IC50取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×104個／mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL，培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液。以RPMI－1640培養(yǎng)液為稀釋液，將多糖稀釋液進(jìn)行倍比稀釋，獲得1組～8組分別為原液、稀釋2－1、稀釋2－2、稀釋2－3、稀釋2－6、稀釋2－9、稀釋2－10、稀釋2－11共8組含不同粗多糖濃度的培養(yǎng)液，每孔加培養(yǎng)液200μL，以不加藥的細(xì)胞培養(yǎng)作為陰性對照，以100μg／mL環(huán)磷酰胺（CTX）作為陽性對照，以不加藥的培養(yǎng)基作為空白對照，每個藥物濃度設(shè)8個平行，分別培養(yǎng)24、48、72h后，吸去上清，加入5mg／mL的MTT每孔20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200μL，振蕩10min，用酶標(biāo)儀測490nm波長下各孔的吸光值（OD值），計算PG23多糖對A549細(xì)胞的抑制率。

抑制率（IR）%＝（陰性對照組平均OD值－試驗組平均OD值）÷（陰性對照組平均OD值）×100%；

根據(jù)抑制率，利用PASW Statistics 18軟件計算蒲公英PG23多糖抑A549肺癌細(xì)胞的IC50。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用PASW Statistics 18軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量數(shù)據(jù)以ˉX±SD表示，One－Way ANOVA 分析、Duncan＇s檢驗，以P＜0.05（或P＜0.01）表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PG23發(fā)酵液多糖含量的測定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚－硫酸法，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液在490nm處吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），求得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為A＝0.0098C＋0.0233，線性相關(guān)系數(shù)R2＝0.9931。

用950mL／L乙醇沉淀PG23發(fā)酵上清液，獲得27.54g粗多糖，多糖得率為2.754%。

取多糖稀釋液在490nm處的吸光值為0.747，多糖稀釋液的糖含量為73.85μg／mL，故PG23多糖儲備液的多糖為14.77mg／mL，粗多糖的含量為26.82%。

圖1 葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose content

2.2 PG23發(fā)酵液對A549生長的抑制率和IC50

以RPMI－1640為稀釋液，將多糖稀釋液進(jìn)行倍比稀釋，各培養(yǎng)液中多糖含量見表1。

表1 各組培養(yǎng)液中多糖含量Table1 Polysaccharide contents in different groups mL

以上述培養(yǎng)液為A549肺癌細(xì)胞培養(yǎng)液，以100 μg／mL環(huán)磷酰胺（CTX）作為抗癌藥物的陽性對照，以不加藥的培養(yǎng)細(xì)胞作為陰性對照，培養(yǎng)24h、48h、72 h，采用MTT法測定吸光度（OD值），計算PG23多糖對A549細(xì)胞的抑制率（表2）。

從表2中可以看出，各組A549細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞數(shù)量逐漸增加；PG23多糖對A549細(xì)胞的抑制率以第1天最強(qiáng)，CTX也表現(xiàn)同樣的抑制A549細(xì)胞的趨勢；不同的多糖濃度對A549的抑制率有所不同，第1天第5組（0.23mg／mL）、第6組（28.85μg／mL）、第7組（14.42μg／mL）三組培養(yǎng)液對A549的抑制率超過80%，為高度抑制（P＜0.01），第8組（7.21μg／mL）的抑制率超過50%，為中度抑制，這四組培養(yǎng)液的抑制率均高于CTX陽性對照，第4組（1.85mg／mL）培養(yǎng)液的抑制率同CTX陽性對照相當(dāng)，為49%，而第2組（7.38mg／mL）和第1組（14.77mg／mL）培養(yǎng)液不僅抑制率下降明顯，第1組培養(yǎng)液還表現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞生長的趨勢（圖2）。

表2 PG23多糖對A549的抑制率Table2 The inhibitory rate in A549cells after treatment with polysaccharide from PG23broth

圖2 多糖濃度與抑制率的相關(guān)性曲線圖Fig.2 The relativity curve between polysaccharide concentration and inhibited rate

根據(jù)抑制率，用PASW statistics 18計算PG23發(fā)酵液多糖對A549抑制率的IC50為1.073mg／mL（24h）。

3 討論

多糖類物質(zhì)具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等多種功效，多糖作為藥物最初是在食用真菌方面，例如，蟲草多糖、靈芝多糖、香菇多糖、猴頭多糖和灰樹花多糖等等，通過淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，提高身體抵抗病毒和細(xì)菌入侵的能力[10－11]，食用菌多糖有著極強(qiáng)的抗氧化特性，能夠清除多種自由基對人體的傷害，通過提高機(jī)體溶菌酶、SOD、CAT的含量發(fā)揮抗氧化、抗衰老功能[12]。

對于藥物植物內(nèi)生真菌產(chǎn)抗癌性多糖類物質(zhì)的研究國內(nèi)外并不多見。蒲公英是一類清熱解毒類常用抗菌、抗病毒類藥物，其藥性成分比較復(fù)雜，多種成分相互協(xié)調(diào)發(fā)揮多種生物活性作用，對于蒲公英內(nèi)生真菌的研究，目前僅限于筆者，在研究出PG2的抗菌物質(zhì)主要為多糖后，后續(xù)分離的PG23菌株具有多種生物活性，其發(fā)酵液中也含大量的多糖類物質(zhì)，經(jīng)測量多糖含量為0.23mg／mL，通過研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英內(nèi)生真菌發(fā)酵液多糖的抗癌效果并不與多糖濃度成正比，而是具有最佳作用濃度，抑制A549肺癌細(xì)胞的最佳多糖濃度為14.42μg／mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蒲公英多糖的抑癌效果[4]；在作用后24h內(nèi)，230μg／mL ～14.42 μg／mL的PG23多糖濃度抑制A549肺癌細(xì)胞的抑制率（84.45%～63.96%）均高于環(huán)磷酰胺的陽性對照（49.47%），通過計算，IC50為1.073mg／mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于山茱萸多糖對 A549的IC50（37.2mg／mL）[13]，證明PG23發(fā)酵液具有較好的抑制肺癌A549細(xì)胞的效果。PG23對肺癌A549細(xì)胞的抑制作用機(jī)理，以及PG23多糖的其他生物活性還需要進(jìn)一步深入研究。

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