脈絡(luò)寧對大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護作用

李軍凱，楊高潮，黃 河

臨床上血栓形成、外傷、急性動脈栓塞、各種胸腹手術(shù)、取栓手術(shù)、血管重建、休克治療后、器官移植等不可避免引起器官組織血流阻斷，造成器官、組織缺血，缺血器官、組織內(nèi)會有大量的氧自由基產(chǎn)生，動脈血流恢復后，它們隨血液循環(huán)遍布全身，而氧自由基能夠調(diào)節(jié)、控制白細胞與內(nèi)皮細胞黏附因子之間的表達，促使白細胞和內(nèi)皮細胞之間的黏附，從而使白細胞游出，釋放大量炎癥介質(zhì)、水解酶和氧化酶等生物酶類，破壞內(nèi)皮細胞[1]，使組織損傷加重。各種原因所造成的急性肢體缺血作為最常見外周血管疾病之一，死亡率高達25%，而存活者當中截肢率高達20%[2]，目前對缺血再灌注損傷沒有特別有效的方法，因此很有必要找到一種有效治療缺血再灌注損傷的藥物。

有文獻證明脈絡(luò)寧在心腦血管方面有一定的療效[3]，然而脈絡(luò)寧在肢體缺血再灌注損傷方面的治療作用鮮有報道。本研究旨在研究脈絡(luò)寧是否對肢體缺血再灌注損傷有保護作用。

1 材料及方法

1.1 實驗動物分組及模型建立 健康雄性Wistar大鼠36只，體重（210±20）g，隨機分為空白組、缺血再灌注組、脈絡(luò)寧組，每組12只。術(shù)前大鼠禁食12 h，禁水6 h，麻醉前每只大鼠給予腹腔注射脈絡(luò)寧1mL，空白組和缺血再灌注組腹腔注射同等劑量生理鹽水。采用烏拉坦（40 mg/100 g）腹腔注射麻醉，麻醉滿意后15 min后行腹部正中切口，進入腹腔，剪開后腹膜，鈍性分離出腹主動脈，在髂總動脈分叉處上方0.5 cm處，用無創(chuàng)動脈夾夾閉腹主動脈，以阻斷平面以下管腔變扁平及動脈搏動消失為缺血造模成功，關(guān)腹。2 h后開腹，取下血管夾，血管夾處以下腹主動脈有搏動后關(guān)腹腔，恢復腹主動脈血流4 h，空白組步驟基本同缺血再灌注組，但不做腹主動脈阻斷。

1.2 藥物與試劑 脈絡(luò)寧，金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠，批準文號：國藥準字Z32021102。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 檢測項目和標本制作

1.3.1 血清SOD、MDA的測定 各組大鼠于再灌注4 h后從下腔靜脈采血2mL，以3 000 r/min離心10 min后取血清，裝入EP管中，－40℃凍存?zhèn)溆?。MDA的檢測采用硫代巴比妥酸法（TBA法），SOD的檢測采用黃嘌呤氧化酶法。

1.3.2 制作石蠟切片與光鏡觀察 采血結(jié)束時迅速取大鼠后肢腓腸肌組織，常規(guī)HE染色。

1.4 統(tǒng)計學處理 所得實驗數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進行分析，統(tǒng)計描述用均數(shù)±標準差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，進行方差齊性檢驗，采用單因素方差分析的單向分類的方差分析（One－Way ANOVA）及LSD檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 脈絡(luò)寧對血清SOD活性和MDA含量的影響 缺血再灌注組與空白組比較，血清SOD活性降低（P＜0.05），MDA含量增多（P＜0.05）。脈絡(luò)寧組與缺血再灌注組比較，血清SOD活性升高（P＜0.05），MDA含量減少（P＜0.05）。脈絡(luò)寧組與空白組比較各指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 不同組別血清SOD和MDA值比較（±s）

表1 不同組別血清SOD和MDA值比較（±s）

與空白組比較，1）P＜0.05；與缺血再灌注組比較，2）P＜0.05

組別 n SOD（U/mL） MDA（nmol/mL）12 253.68±22.97 6.79±2.24缺血再灌注組 12 221.01±20.951） 12.25±1.981）脈絡(luò)寧組 12 243.56±23.702） 10.06±3.032）空白組

2.2 各組大鼠骨骼肌病理改變 光鏡下觀察大鼠腓腸肌形態(tài)改變：空白組縱切面上肌纖維染色均勻，橫紋清晰，肌纖維未見壞死及炎細胞浸潤；缺血再灌注組縱切面上肌纖維體積增大，染色變淡，有不同程度腫脹，可見空泡，可見部分橫紋；脈絡(luò)寧組肌纖維腫脹減輕，空泡基本消失，橫紋結(jié)構(gòu)恢復。

3 討 論

缺血再灌注損傷的研究歷來備受臨床工作者尤其是外科醫(yī)生的重視，隨著介入技術(shù)的發(fā)展，醫(yī)源性血管創(chuàng)傷的并發(fā)癥相對增多，然而，眾所周知，減輕此類損傷最有效的辦法是盡量縮短缺血時間，在實際工作當中，部分治療的缺血時間不好控制，從而導致一些患者因缺血時間過長喪失治療機會，一些患者因術(shù)后血流動力學改變而治療失敗，增加了此類損傷的致死率和致殘率。防治肢體再灌注損傷，設(shè)法減輕肌肉缺血損傷的程度，對挽救肢體，降低截肢率，恢復肢體功能具有很重要的意義，因此在盡量縮短缺血時間的同時，能找到一種有效輔助治療缺血再灌注損傷肢體的藥物很有必要。

本實驗中缺血再灌注組與空白組相比，SOD活性下降（P＜0.05），MDA含量增加（P＜0.05）；脈絡(luò)寧組與缺血再灌注組相比，SOD活性升高但低于空白組，MDA含量比缺血再灌注組低，但高于空白組；脈絡(luò)寧組和空白組SOD活性及MDA含量相比無統(tǒng)計學意義。這說明在生理狀態(tài)下，機體內(nèi)能夠產(chǎn)生少量的氧自由基，它們在維持細胞正常生理活動，如：內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、有絲分裂和細胞信號轉(zhuǎn)導，發(fā)揮著重要作用，并且與自由基清除劑能保持動態(tài)平衡，肢體缺血再灌注后，大量氧自由基釋放，進入血液，消耗體內(nèi)的抗氧化酶超氧化物歧化酶，導致氧化－抗氧化系統(tǒng)失衡大量氧自由基釋放入血，引起MDA升高，但是缺血再灌注產(chǎn)生大量氧自由基會對機體造成嚴重損傷[4]。大量氧自由基能夠氧化細胞膜中的脂質(zhì)，使細胞膜的正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，進而增加其通透性，使細胞膜破裂，最終產(chǎn)生更多的氧自由基。SOD是清除氧自由基的專一歧化酶，可以反映體內(nèi)的抗氧自由基能力，丙二醛是氧自由基攻擊生物膜的不飽和脂肪酸所形成的脂質(zhì)過氧化物，反映機體脂質(zhì)過氧化程度，間接反映組織內(nèi)氧自由基水平。一旦脂質(zhì)氧化被引發(fā)，則可呈級聯(lián)反應(yīng)，進一步擴散和放大。再Park等[5]通過在制作的大鼠提睪肌皮瓣的缺血再灌注的模型研究中發(fā)現(xiàn)，SOD可以清除組織器官中產(chǎn)生的多余氧自由基，使黏附分子的表達受到抑制，減少炎癥細胞在骨骼肌的聚集，保護肢體免受缺血再灌注損傷。用藥后SOD含量升高，MDA含量降低，說明脈絡(luò)寧能提高SOD含量，增強其活力，與此同時減弱機體脂質(zhì)過氧化程度，減輕細胞損傷程度，達到保護缺血再灌注損傷肢體的作用。

病理切片結(jié)果顯示，與空白組比較，缺血再灌注組骨骼肌纖維水腫；其作用機制可能是：組織缺血后首先發(fā)生的病理變化是水腫，因為線粒體受損時ATP的生成量減少，Na泵功能障礙會導致細胞內(nèi)鈉離子和水的過多蓄積，之后機體產(chǎn)生大量氧自由基，炎性介質(zhì)，無機磷酸鹽，乳酸和嘌呤核苷酸等代謝產(chǎn)物，它們的蓄積可增加滲透壓負荷，進一步加重組織損傷；加重組織損傷的重要因素之一是炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵步驟是中性粒細胞的激活、移行、邊附及在血管外周組織中大量聚集，它在肢體缺血再灌注損傷時期起著關(guān)鍵作用[6]，最終使血管壁的通透性增大，組織水腫。與缺血再灌注組比較，脈絡(luò)寧組骨骼肌纖維水腫減輕，部分肌纖維接近正常，這說明脈絡(luò)寧可以減輕組織水腫，能顯著保護缺血再灌注時骨骼肌細胞SOD的活力，減少MDA的生成量，保護骨骼肌細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，對肢體缺血再灌注損傷有明顯的保護作用。此作用可能與以下兩方面有關(guān)：一方面脈絡(luò)寧具有活血化瘀、增加血流量、增加毛細血管開放，改善機體微循環(huán)、降低氧耗、改善肌細胞代謝等作用，能夠保護機體內(nèi)源性SOD活力，減輕過量蓄積的氧自由基對缺血再灌注損傷骨骼肌細胞膜脂質(zhì)過氧化的損傷程度[6]；另一方面可能是脈絡(luò)寧的物理作用，通過藥物的滲透作用，減少水進入細胞內(nèi)，并將水從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞外，進而維持細胞的正常容積，防止細胞及其細胞器破裂，起到減輕細胞水腫的作用。

缺血再灌注損傷涉及的病理過程十分復雜，它是一個多因素參與，多機制共同作用的結(jié)果，能引起許多免疫組織、器官病理生理過程的改變，比如血管內(nèi)皮細胞功能障礙，無復流現(xiàn)象，毛細血管通透性改變，中性粒細胞浸潤，自由基產(chǎn)物過多堆積，缺氧和微循環(huán)改變等[7－10]。而這些病理改變?nèi)绻貌坏郊皶r改善，將引起以下變化：動脈血流的恢復會引起細胞發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)以及機體全身的生化反應(yīng)，從而導致缺血再灌注肌肉的水腫、壞死以及結(jié)構(gòu)破壞，最終使其功能受損，嚴重時不僅引起缺血器官組織本身受損，甚至會引起機體其他器官如肝、腎、肺等遠隔器官的結(jié)構(gòu)、功能損害[11]，甚至引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），給機體造成不可逆損傷。肢體缺血再灌注損傷所導致的大量紅細胞、血小板聚集，白細胞黏著附壁、白色微血栓的形成等均可，減慢血液流動速度，減少組織器官氧供，而缺氧、血液黏稠度的增高、血液流動速度的減慢又可進一步促進紅細胞聚集、血小板白色微栓形成[12]。這種惡性循環(huán)可解釋再灌注后隨時間的推移，微循環(huán)障礙逐漸加重。而脈絡(luò)寧毒副反應(yīng)小，作用溫和，通過多種途徑來改善血液流變，擴張血管，降低血管阻力，增加毛細血管開放率，促進側(cè)支循環(huán)的建立，增加局部血流，改善血液流變性，改善微循環(huán)，提高組織和器官抗缺血、缺氧能力，從而降低氧耗，改善細胞代謝，以對抗肢體缺血產(chǎn)生氧自由基的損傷作用；另外通過改善全血粘度，增加纖溶酶原水平，改善機體的凝血機制，提高組織型纖溶酶原激活物活性，降低纖維蛋白原含量，抑制血小板聚集，清除機體過多自由基等保護動脈內(nèi)皮細胞，解除血管痙攣和抗凝血的作用，可以防止血栓形成[13]，起到保護缺血再灌注損傷肢體的作用。本實驗研究結(jié)果表明，脈絡(luò)寧對缺血再灌注損傷的肢體有保護作用。

[1] 胡國富，金畢夏.佛伐他汀對下肢缺血再灌注損傷的保護作用[J].華中醫(yī)學雜志，2007，31（3）：170.

[2] Dick F，Li J，Giraud MN，et al.Basic control of reperfusion effectively protects against reperfusion injury in a realistic rodent model of acute limb ischemia[J].Circulation，2008，118（19）：1920－1928.

[3] 陳藍，王蔚，王選，等.脈絡(luò)寧治療缺血性腦血管病的臨床療效的Meta分析[J].中風與神經(jīng)疾病雜志，2010，27（4）：313－316.

[4] 孫海波，魏俊強.骨骼肌缺血再灌注損傷中自由基的產(chǎn)生機制及治療研究進展[J].中國矯形外科雜志，2011，19（4）：305.

[5] Park JW，Qi WN，Cai Y，et al.Skeletal muscle reperfusion injury is enhanced in extracellular superoxide dismutase knockout mouse[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，1：181－187.

[6] 王岱君，王金平，鞠學紅，等.脈絡(luò)寧對兔肢體缺血再灌注損傷的防護作用[J].中華創(chuàng)傷雜志，2004，20（4）：237.

[7] Nadaud S，Philippe M，Amal JF，et al.Sustained increase in aortic endothelial nitric oxide synthase expression in vivo in a model of chronic high blood flow[J].Circ Res，1996，79（4）：857－886.

[8] Thiagarajan RR，Winn RK，Hadan JM.The role of leukocyte and endothelial adhesion molecules in ischemia reperfusion injury[J].Thromb Haemost，1997，78（1）：310－314.

[9] Crinnion JN，Homer－Vanniasinkam S，Parkin SM，et al.Role of neutrophil－endothelial adhesion in skeletal muscle reperfusion injury[J].Br J Surg，1996，83（2）：251－254.

[10] Allen DM，Chen LE，Seaber AV，et al.Pathophysiology and related studies of the no reflow phenomenon in skeletal muscle[J].Clin Odhop Relat Res，1995（314）：122－133.

[11] Kearns SR，Monnoley D，Murray P，et al.Oral vitamin C attenuat es acute ischaemia reperfusion injury in skeletal[J].J Bone Joint Surg Br，2001，83（8）：1202.

[12] 范里，杜飛，劉世清，等.丹參對肢體缺血再灌注損傷保護的實驗研究[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志，2003，11（5）：11.

[13] 吳雙貴，談發(fā)金.注射用脈絡(luò)寧注射液活血化瘀作用的實驗研究[J].湖南中醫(yī)雜志，2009，25（3）：113.