骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子聯(lián)合移植對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷修復(fù)的研究1）

梁 磊，陳來照，段虎斌，郝 強(qiáng)，成 睿

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）的發(fā)病率已居全身各種創(chuàng)傷的首位，極大地影響患者的生命健康和生活質(zhì)量，給患者家庭和社會(huì)造成了極大的負(fù)擔(dān)[1]。由于神經(jīng)元的再生能力極差，目前尚無理想的治療方法。目前大量研究顯示，移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）治療各種腦損傷是一種潛力巨大的療法[2]。然而，TBI發(fā)生時(shí)，腦血管在暴力作用下直接遭到破壞，繼而出現(xiàn)的腦水腫又進(jìn)一步加重腦缺血的程度。這樣，在腦缺血環(huán)境下，單純移植BMSCs能否獲得滿意療效令人擔(dān)憂。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在體內(nèi)是促血管生成劑。聯(lián)合移植BMSCs與外源性VEGF能否通過改善受損腦組織的微循環(huán)而提升療效？這一療法對(duì)腦組織中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）等細(xì)胞因子的表達(dá)有何影響？本研究將就此做一初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔雄性2月齡SD大鼠2只，體重210 g，用于培養(yǎng)BMSCs；清潔雄性3月齡SD大鼠40只，體重220 g～250 g，用于建立TBI模型。均由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑 DMEM培養(yǎng)基（Hyclon，北京）；無支原體胎牛血清（杭州四季青）；胰酶蛋白（Solarbio，北京）；一抗BDNF兔多克隆抗體（Epitomics，美國(guó)加利福尼亞）；即用型SABC免疫組化染色試劑盒（博士德，武漢）。

1.2.2 儀器 超低溫冰箱（SANYO，日本）；高溫蒸汽滅菌器（新諾，上海）；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（Minispin plus Eppendorf，德國(guó)）；超凈工作臺(tái)（博迅，上海）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo，美國(guó)）；倒置相差顯微鏡（Leica，德國(guó)）；臺(tái)式牙科鉆；自由落體垂直打擊儀（太原鋼鐵集團(tuán)加工）；微量注射器；大鼠腦立體定向儀（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院加工）。

1.3 TBI模型的建造 將40只SD大鼠隨機(jī)分為單獨(dú)移植BMSCs組（BMSCs組）、單獨(dú)應(yīng)用VEGF組（VEGF組）、聯(lián)合移植BMSCs與VEGF組（V＋B組）及對(duì)照組，每組10只。采用改良的Feeny自由落體撞擊方法建造中度TBI模型[3]。用5%水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉并俯臥固定于立體定向儀，頭皮消毒，做頂部正中切口，用牙科鉆在矢狀縫右2 mm和冠狀縫前2 mm交點(diǎn)處開直徑4 mm骨窗。將骨窗與自由落體垂體打擊儀連接妥當(dāng)，以300 g/cm（50 g重錘，下落距離6 cm）功力沖擊大腦皮層。

1.4 BMSCs的分離與培養(yǎng) SD大鼠2只，處死取雙側(cè)股骨，75%酒精浸泡5 min，在超凈工作臺(tái)上剪斷兩端，將骨髓沖出制成細(xì)胞懸液。1 000 r/min離心10 min，棄上清，用DMEM再懸沉淀，1 000 r/min離心10 min，棄上清，得骨髓細(xì)胞。用含12%胎牛血清的培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，以1.0×105個(gè)/mL接種于加有DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37℃5%CO2飽和濕度孵箱培養(yǎng)。24 h后第1次全量換液。3 d后見細(xì)胞覆蓋視野50%，用0.25%胰蛋白酶消化1 min，制成單細(xì)胞懸液1mL，分裝入兩個(gè)培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。72 h后全量換液。接種7 d后見第一代細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底。

1.5 立體定向移植 造模后第7天，將大鼠頭部固定于立體定向儀上，用1 0μL微量注射器分別將濃度為2×1 06/L的BMSCs細(xì)胞懸液、濃度為10 ng/mL的VEGF、含有2×106個(gè)BMSCs和0.01 ng VEGF的細(xì)胞懸液及PBS液各1μL緩慢注入相應(yīng)組傷灶周邊，進(jìn)針深度2 mm。注射后14 d，處死取腦，制成片厚4μm的冠狀石蠟切片。

1.6 HE、尼氏及免疫組化染色 常規(guī)HE染色。用甲苯胺藍(lán)溶液行尼氏染色。用p H＝6.0枸櫞酸鹽溶液行高壓熱抗原修復(fù)1 min 30 s，加5%BSA后，滴加一抗（1∶100），4℃過夜。依次滴加二抗及SABC。DAB顯色，復(fù)染。

1.7 數(shù)碼照片的拍攝 應(yīng)用Image Analysis System 10.0軟件進(jìn)行拍攝。在10×40倍視野下，每張切片拍攝半暗帶及健側(cè)對(duì)稱部（以下簡(jiǎn)稱對(duì)稱部）共2個(gè)部位，每個(gè)部位隨機(jī)拍攝10個(gè)不連續(xù)的視野。

1.8 BDNF數(shù)據(jù)的采集 以細(xì)胞漿及部分胞核中表現(xiàn)有棕黃色顆粒的細(xì)胞為BDNF陽性細(xì)胞。應(yīng)用IPP 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。選取陽性細(xì)胞中的棕黃色區(qū)域，軟件自動(dòng)計(jì)算每個(gè)區(qū)域的累積光密度（IOD，Integrated Optical Density）值，以總和IOD代表每個(gè)視野下的BDNF含量。以10個(gè)視野總和IOD的平均值代表該部位BDNF含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.3軟件分析?？偤虸OD均值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組總和IOD均值間的比較采用單因素方差分析后最小顯著差（LSD）t檢驗(yàn)，各組對(duì)稱部與半暗帶總和IOD均值間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色 對(duì)稱部間質(zhì)致密，神經(jīng)元形態(tài)正常。可見少量小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞；半暗帶間質(zhì)略疏松，神經(jīng)元水腫、密度較對(duì)稱部略低，偶可見皺縮神經(jīng)元。BMSCs組及V＋B組，顆粒細(xì)胞層內(nèi)均可見呈梭形的BMSCs，梭尾朝向分子層。在移植組的半暗帶內(nèi)可見BMSCs。

2.2 尼氏染色 神經(jīng)元胞漿內(nèi)均可見嗜堿性團(tuán)塊狀或顆粒狀尼氏體，半暗帶內(nèi)尼氏體數(shù)量較對(duì)稱部略少。

2.3 免疫組化染色（見表1） BDNF陽性細(xì)胞分布廣泛，在大腦皮層各層、海馬、丘腦等部位均可見到。與陰性對(duì)照切片相比，陽性切片中BDNF主要表達(dá)于神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。陽性顆粒主要位于胞漿內(nèi)，呈環(huán)狀，在部分胞核內(nèi)亦可見少量陽性顆粒。

表1 兩組半暗帶總和IOD均值間的比較（±s）

表1 兩組半暗帶總和IOD均值間的比較（±s）

與對(duì)照組比較，1）P＜0.05

均值之差BMSC組 15 171±3 045組別 半暗帶總和IOD均值 半暗帶與對(duì)稱部總和IOD 526±3 092 VEGF組 18 377±2 220 －3 728±5 0891）V＋B組 21 184±4 8631） －3 332±2 9361）對(duì)照組 17 195±4 338 －5 973±4 6961）

3 討 論

BMSCs是指來源于骨髓，具有多系多向分化潛能，并具有貼壁生長(zhǎng)性的成纖維細(xì)胞樣間充質(zhì)干細(xì)胞[4]。在生長(zhǎng)特征方面具有貼壁生長(zhǎng)性，在形態(tài)方面具有梭形的特征[5]。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)與移植的BMSCs均具有上述特點(diǎn)。

BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員之一，廣泛分布于腦組織[6]。具有下列生物學(xué)作用：抑制興奮性氨基酸的毒性；對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)高鈣；抗氧自由基；抑制細(xì)胞凋亡；促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移與分化[7]。缺血性腦損傷發(fā)生后，BDNF的表達(dá)在7 d開始升高，14 d明顯增多，21 d達(dá)高峰[8]。

半暗帶是指圍繞在中心壞死區(qū)以外的可逆性損傷腦組織[9]，是腦挫裂傷后繼發(fā)性損害的重要組成部分。減輕半暗帶病理損害與修復(fù)可逆性受損腦組織是治療創(chuàng)傷性腦損傷的重要目標(biāo)。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，可以認(rèn)為聯(lián)合移植組半暗帶中BDNF含量較對(duì)照組高。目前，BMSCs移植治療TBI的機(jī)制主要有如下學(xué)說：BMSCs直接分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，替代受損細(xì)胞發(fā)揮作用；BMSCs通過自分泌或旁分泌作用促進(jìn)受損腦組織修復(fù)；BMSCs調(diào)節(jié)受損腦區(qū)炎癥因子的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)。Runjiang等[10]證實(shí)BMSCs在體外培養(yǎng)時(shí)可分泌BDNF等6種生長(zhǎng)因子。它們不僅可以抑制細(xì)胞凋亡，還能上調(diào)內(nèi)源性VEGF和VEGF受體－2的表達(dá)。VEGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有選擇性刺激作用，可促進(jìn)血管的生成。本課題組前期系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組血管計(jì)數(shù)多于對(duì)照組；聯(lián)合移植組抑制細(xì)胞凋亡的作用明顯。故筆者認(rèn)為，聯(lián)合移植組可能通過如下機(jī)制提高半暗帶中BDNF的含量：BMSCs分泌BDNF；BMSCs分泌的生長(zhǎng)因子與外源性VEGF共同使半暗帶新生血管數(shù)量增多，微循環(huán)得以改善，進(jìn)而促使BMSCs增殖、分化，促進(jìn)受傷腦組織修復(fù)，最終使BDNF表達(dá)增多；BMSCs抑制半暗帶細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制BDNF表達(dá)的減少。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，可以認(rèn)為除BMSCs組外，其余各組半暗帶BDNF含量均較對(duì)稱部低。尼氏染色亦支持本結(jié)論：作為蛋白質(zhì)合成與分泌場(chǎng)所的尼氏體在半暗帶中的數(shù)量較健側(cè)對(duì)稱部少。

可以認(rèn)為，TBI發(fā)生后半暗帶中BDNF含量減少，通過立體定向聯(lián)合移植BMSCs與VEGF可有效抑制該病理過程。從BDNF生物學(xué)作用分析，本方法具有減輕TBI繼發(fā)性病理損害的作用，療效可能較單純移植BMSCs更好。Miki等[11]在治療腦卒中的研究中也表明，VEGF轉(zhuǎn)基因BMSCs移植與普通BMSCs移植相比療效更好。本研究中針對(duì)BMSCs組的部分統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，尚難做出合理解釋，需進(jìn)一步深入研究。

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