瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平對ox－LDL誘導(dǎo)的人單核巨噬細(xì)胞MMP－9mRNA 和蛋白表達(dá)的影響1）

張文英，高 振，屈巧芳，申曉彧

動脈粥樣硬化（atherosc lerosis，AS）是1個復(fù)雜的炎癥免疫反應(yīng)病理過程[1]。其中，巨噬細(xì)胞吞噬氧化修飾的低密度脂蛋白（ox－LDL）在 AS的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[2]。各種致動脈粥樣硬化的因素促進(jìn)血管局部炎癥介質(zhì)的生成，啟動血管壁的炎癥反應(yīng)是AS發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制。其中ox－LDL是AS炎癥反應(yīng)中重要的危險因素[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，ox－LDL可增加單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶－9（matrix metalloproteinase－9，MMP－9）表達(dá)并增強(qiáng)其活性，是細(xì)胞功能和基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子[4]。

瑞舒伐他汀（rosuvastatin）是新一代3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A（HMG－Co A）還原酶抑制劑，已有試驗證明瑞舒伐他汀可抑制ox－LDL誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞 MMP－9mRNA和蛋白的表達(dá)[5]。氨氯地平（amlodipine）是廣泛用于臨床的第三代新型長效二氫吡啶類鈣通道阻滯劑（calcium channel blockers，CCB），臨床上主要應(yīng)用于高血壓治療的一線用藥。雖然，有報道稱氨氯地平可以抑制單核細(xì)胞Lox－1、MMP－9的表達(dá)，從而起到穩(wěn)定斑塊的作用，但瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平能否加強(qiáng)抑制高血壓合并冠心病患者單核巨噬細(xì)胞MMP－9mRNA和蛋白表達(dá)的作用，起到使斑塊更加穩(wěn)定的作用有待進(jìn)一步實驗證明。

本研究以健康人外周血單核巨噬細(xì)胞為對象，探討利用ox－LDL誘導(dǎo)后，不同濃度瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平對MMP－9mRNA和蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象 健康成人靜脈血液來自山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院體檢中心；人淋巴細(xì)胞分離液（Lymphocytes Separation Medium1077）為上海華精生物高科技有限公司產(chǎn)品；RPMI－1640培養(yǎng)液；胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；ox－LDL為北京協(xié)生生物科技有限公司產(chǎn)品；FITC－CD14抗體購自日本Beckman Coulter公司。RNA提取試劑盒（TransZol）購自北京全式金生物技術(shù)公司；逆轉(zhuǎn)錄－多聚酶聯(lián)反應(yīng)（RT－PCR）試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)公司；引物序列由上海生工生物有限公司合成；酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒購自美國R＆D公司；瑞舒伐他汀為阿斯利康公司饋贈；氨氯地平為輝瑞制藥有限公司饋贈；其他試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 人單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)和鑒定 密度梯度離心法分離健康人單核細(xì)胞。肝素抗凝靜脈血30mL分10個試管，RPMI－1640液1倍稀釋并充分混勻，分別緩慢加入等比例淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2 000 r/min離心20 min后，吸取中間環(huán)狀云霧狀淋巴細(xì)胞層，再以3mL PBS液充分混勻，1 500 r/min離心洗滌2次；10%胎牛血清的RPMI－1640各5mL將細(xì)胞吹開混勻，將細(xì)胞懸液每培養(yǎng)瓶4mL，并且每孔2mL再種于12孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)至2代～4代后于細(xì)胞指數(shù)生長期用于誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化實驗。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化時，以40 ng/mL的PAM無胎牛血清RPMI－1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h～72 h，待細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞后以RPMI－1640培養(yǎng)液洗滌3次，置于10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。臺盼藍(lán)染色法測定細(xì)胞存活率。單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞用特異性熒光素標(biāo)記的CD14細(xì)胞表面抗體，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.3 試驗分組 試驗共分8組?？瞻讓φ战M：單獨單核巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24 h；ox－LDL對照組：單核巨噬細(xì)胞經(jīng)ox－LDL 100μg/mL誘導(dǎo)后單獨培養(yǎng)24 h；瑞舒伐他汀組：單核巨噬細(xì)胞用ox－LDL 100μg/mL誘導(dǎo)后培養(yǎng)2 h后，分3組，分別單獨加入瑞舒伐他?。ǜ?.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L）培養(yǎng)24 h；瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平組：單核巨噬細(xì)胞用ox－LDL 100μg/mL誘導(dǎo)后培養(yǎng)2 h后，分3組，第1組：加瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平各0.01μmol/L作用24 h；第2組：加瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平各0.1μmol/L作用24 h；第3組：加瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平各1.0μmol/L作用24 h。

1.4 半定量RT－PCR檢測 MMP－9m RNA的表達(dá)水平

1.4.1 RNA提取 棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，每瓶加入1.0 mL Trizol，依次加入氯仿、異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌后略晾干，溶于25μL DEPC中。核酸紫外分析儀檢測，根據(jù)260/280比值，所有樣品的A260/A280的比值均介于1.9～2.0。并根據(jù)260 nm的吸光度值對樣品的總RNA進(jìn)行初步定量，確定樣品中RNA純度和含量。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在20μL體系中進(jìn)行：含1μg RNA，20 mg/L 的 oligo（d T）引 物，1.0 mmol/L d NTP，20 U Rnase抑制劑，1×Buffer，200UM－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。于PCR儀上42℃反應(yīng)1 h，72℃滅活10 min后保存于－20℃冰箱中。

1.4.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng) MMP－9上游引物序列為：5′－TCCCTGGAGACCTGAGAACC－3′；下游引物序列為：5′－GGCAAGTCTTCCGAGTAGTTT－3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s，循環(huán)29次；末次延伸7 min，產(chǎn)物長度為307bp。β－actin上游引物序列：5′－CCTGAGGCACTCTTCCAG－3′，下游引物序列：5′－TCACACTTCATGATGGA－3′，產(chǎn)物大小100bp。

1.4.4 凝膠電泳 取PCR產(chǎn)物10μL在瓊脂糖凝膠上電泳，計算機(jī)凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，Toptal軟件分析灰度值，以各條帶與B－actin內(nèi)參條帶灰度的比值，代表MMP－9mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法（ELISA法）測定 MMP－9蛋白含量的表達(dá) 六孔培養(yǎng)板的上清液進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附雙抗夾心法（enzyme linked immuno－sorbent assay，ELISA）測定，實驗操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，每組實驗重復(fù)7次。

2 結(jié) 果

2.1 單核巨噬細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞術(shù)鑒定 單核巨噬細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、誘導(dǎo)后，25×16倍倒置顯微鏡光鏡下觀察，部分細(xì)胞為多角形，并且易于聚積、貼壁，說明已由單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞鑒定，鑒定細(xì)胞多為單核巨噬細(xì)胞，符合實驗要求。

2.2 對ox－LDL誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞MMP－9m RNA及蛋白表達(dá)的影響 已經(jīng)試驗證明經(jīng)ox－LDL誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞，可使MMP－9mRNA和蛋白的表達(dá)顯著增加，而加入瑞舒伐他汀共同培養(yǎng)24 h后，MMP－9mRNA和蛋白的表達(dá)明顯受到抑制，這種抑制作用隨加入瑞舒伐他汀劑量的增加而愈顯著，尤其當(dāng)瑞舒伐他汀為10.0μmol/L幾乎完全抑制了 MMP－9mRNA和蛋白的表達(dá)[5]。本研究驗證，瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平后可使MMP－9mRNA和蛋白的表達(dá)較單獨加入瑞舒伐他汀時明顯下降。

2.2.1 對ox－LDL誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞 MMP－9m RNA表達(dá)的影響 與空白對照組比較，ox－LDL對照組、瑞舒伐他汀組MMP－9mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與空白對照組比較，ox－LDL誘導(dǎo)后不同劑量（0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L）瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平組MMP－9mRNA表達(dá)也增加（P＜0.05）；與ox－LDL對照組、瑞舒伐他汀組比較，不同劑量（0.01 μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L）瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平組MMP－9mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；經(jīng)ox－LDL誘導(dǎo)后，不同劑量（0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L）瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平各組之間比較，隨著瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平劑量增加MMP－9mRNA表達(dá)逐漸降低（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組MMP－9mRNA表達(dá)水平（±s）

表1 各組MMP－9mRNA表達(dá)水平（±s）

0.140 1±0.025 0 0.140 1±0.025 0 ox－LDL組 0.744 3±0.135 3 0.785 6±0.046 0 0.01μmol/L組 0.435 4±0.048 1 0.371 5±0.018 6 0.1μmol/L組 0.373 7±0.025 4 0.290 8±0.016 3 1.0μmol/L組組別 瑞舒伐他汀 瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平空白對照組0.262 8±0.036 4 0.226 8±0.015 5

2.2.2 對ox－LDL誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞MMP－9蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組比較，ox－LDL對照組、瑞舒伐他汀組MMP－9蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與空白對照組比較，ox－LDL誘導(dǎo)后加入不同劑量瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平，各劑量（0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L）組 MMP－9蛋白表達(dá)均是增加的，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與ox－LDL對照組、瑞舒伐他汀組比較，不同劑量（0.01μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L）瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平各組 MMP－9蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），這種降低隨著瑞舒伐他汀及氨氯地平劑量的增加而愈加顯著；經(jīng)ox－LDL誘導(dǎo)后，不同劑量（0.01 μmol/L、0.1μmol/L、1.0μmol/L）瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平各組之間比較，隨著瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平劑量增加 MMP－9蛋白表達(dá)逐漸降低（P＜0.05）。說明瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平幾乎完全抑制了MMP－9蛋白的表達(dá)。詳見表2。

表2 各組MMP－9蛋白表達(dá)水平（±s）

表2 各組MMP－9蛋白表達(dá)水平（±s）

0.143 8±0.024 9 0.140 1±0.025 0 ox－LDL組 0.744 3±0.135 3 0.785 6±0.046 0 0.01μmol/L組 0.435 4±0.048 1 0.371 5±0.018 6 0.1μmol/L組 0.373 7±0.025 4 0.290 8±0.016 3 1.0μmol/L組組別 瑞舒伐他汀 瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平空白對照組0.262 8±0.036 4 0.226 8±0.015 5

3 討 論

ox－LDL在動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用，ox－LDL參與內(nèi)皮損傷、黏附分子的表達(dá)、白細(xì)胞的募集和潴留、泡沫細(xì)胞和血栓形成。另外，ox－LDL可刺激人單核巨噬細(xì)胞MMP－9的基因表達(dá)，增加基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，有可能促進(jìn)粥樣硬化斑塊內(nèi)基質(zhì)的降解，形成易損的斑塊，并且，在ox－LDL存在下，MMP－9表達(dá)維持在較高水平，MMP－9過度的表達(dá)則抑制平滑肌增殖，促使其凋亡，減弱斑塊穩(wěn)定性，參與了斑塊破裂的進(jìn)程，促進(jìn)粥樣硬化病變和血栓的形成，因此ox－LDL對人單核巨噬細(xì)胞MMP－9基因表達(dá)的影響，是動脈粥樣硬化病變的關(guān)鍵因素之一[6－8]。

細(xì)胞外基質(zhì)降解是斑塊不穩(wěn)定的主要原因。MMP是一類蛋白酶家族，主要由成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞及斑塊中巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞合成與分泌。MMP能特異性降解細(xì)胞外基質(zhì)和斑塊纖維帽，其表達(dá)增加、活性增強(qiáng)可使斑塊穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致斑塊破裂[9]。有研究顯示有臨床急性缺血性腦卒中組患者頸動脈粥樣斑塊中的MMP－9逆轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平明顯高于無臨床卒中事件組和正常頸動脈組[10]，與文獻(xiàn)[11]研究結(jié)果類似。結(jié)果提示MMP－9可能是導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的主要因素。

他汀類藥物為 HMG－Co A還原酶抑制劑，其調(diào)脂作用肯定，并且可明顯降低致死性和非致死性心血管事件的發(fā)生，從而廣泛用于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的一級和二級預(yù)防[12]。瑞舒伐他汀是一種被攝入后易進(jìn)入動脈內(nèi)膜的抗氧化質(zhì)，在改善高膽固醇血癥患者的脂類水平方面，明顯優(yōu)于阿托伐他汀、辛伐他汀和普伐他汀[13]，可極大程度降低心血管事件的發(fā)生率。有研究表明，瑞舒伐他汀可降低斑塊體積，抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂蛋白的積累，降低主動脈弓的低密度脂蛋白與低密度脂蛋白的斑塊比例[14]。

近年來，許多研究資料提出氨氯地平在不降低血脂及血壓的條件下，能延緩AS早期斑塊的形成，這一作用可能與其強(qiáng)親脂性和細(xì)胞膜上精確定位有關(guān)。氨氯地平是L型CCB，除具有此型的特性外，還具有與此型通道無關(guān)的多效性。這種作用不僅僅表現(xiàn)為對心血管的保護(hù)作用，還體現(xiàn)對頸動脈的保護(hù)作用，通過抗炎、抗氧化應(yīng)激和保護(hù)內(nèi)皮功能等多種機(jī)制實現(xiàn)。

氨氯地平降低血壓主要是依靠其對鈣通道的調(diào)節(jié)，然而其抗AS的許多機(jī)制并不依賴于其對鈣通道的調(diào)節(jié)作用。受損傷的內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)多種炎性因子，如細(xì)胞黏附分子、血管細(xì)胞間黏附分子和趨化因子等，而氨氯地平抑制這些因子的表達(dá)。單核細(xì)胞趨化蛋白1促使單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、遷入內(nèi)皮下，攝取脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞是AS的早期病變。在抑制一氧化氮（nitric oxide，NO）致小鼠AS模型中，氨氯地平不僅抑制AS斑塊處單核細(xì)化蛋白1的表達(dá) ，而且下調(diào)小鼠外周血單核細(xì)胞上單核趨化蛋白1受體的表達(dá)和Rho活性。PREVENT試驗結(jié)果表明，與安慰劑相比，冠心病患者長期服用氨氯地平可使心絞痛和心功能衰竭發(fā)作減少，血管重建率降低[15]。氨氯地平抑制白介素－1誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶－1水平升高及其激發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞溶膠原活性的增強(qiáng)，不僅影響酶的活性與表達(dá)，還能調(diào)節(jié)此酶組織抑制劑的轉(zhuǎn)錄，呈劑量依賴性抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MMP－2和9mRNA的表達(dá)，這可能對穩(wěn)定AS斑塊，減少其破裂具有重要作用[16，17]。目前有研究表明，氨氯地平可以抑制單核細(xì)胞Lox－1、MMP－9的表達(dá)，從而起到穩(wěn)定斑塊的作用。

本研究探討了單核巨噬細(xì)胞經(jīng)ox－LDL誘導(dǎo)后，MMP－9 m RNA和蛋白的表達(dá)較未經(jīng)ox－LDL誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞顯著增加，而使用瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)后 MMP－9m RNA和蛋白的表達(dá)較單獨使用瑞舒伐他汀顯著下降，并隨著瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平計量的增加，下降的愈加顯著。且這種抑制作用隨著瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平劑量的增加而愈顯著，并呈劑量－效應(yīng)關(guān)系。

本研究探討了瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平干預(yù)ox－LDL誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞 MMP－9mRNA及蛋白表達(dá)之間的關(guān)系，通過實驗證明瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平可降低經(jīng)ox－LDL誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞MMP－9m RNA及蛋白表達(dá)，且較單獨使用瑞舒伐他汀抑制作用增強(qiáng)?？紤]瑞舒伐他汀聯(lián)合氨氯地平可能通過ox－LDL途徑抑制單核巨噬細(xì)胞表達(dá) MMP－9，從而起到穩(wěn)定粥樣斑塊和抗炎的作用，從而改善冠心病患者預(yù)后。但未對其細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體機(jī)制做進(jìn)一步研究，需進(jìn)一步研究探討。

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