亞低溫預(yù)處理大鼠脊髓內(nèi)手術(shù)模型的建立

程 光 楊杉杉

(河北聯(lián)合大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室 河北 唐山 063000;①唐山市眼科醫(yī)院)

臨床上，因脊髓內(nèi)腫瘤、動靜脈畸形、空洞等必須施行手術(shù)的病例比較多見，但髓內(nèi)手術(shù)的銳性切開與牽拉本身也是一種損傷，常常會因此而導(dǎo)致嚴(yán)重不良后果，有的甚至因繼發(fā)截癱而遺恨終身。如何預(yù)防或減少這種醫(yī)源性脊髓損傷一直是神經(jīng)外科工作者追求的目標(biāo)。有許多文獻(xiàn)表明[1～3]，低溫，尤其是局部亞低溫的治療具有肯定的脊髓神經(jīng)保護(hù)作用。根據(jù)這一原理，設(shè)想如果在切開脊髓前局部用低溫技術(shù)將脊髓進(jìn)行亞低溫預(yù)處理，是否也可以減輕髓內(nèi)手術(shù)時(shí)因切開、牽拉、暴露等操作導(dǎo)致的脊髓副損傷，發(fā)揮其保護(hù)作用?為了探討亞低溫預(yù)處理對減輕脊髓內(nèi)手術(shù)醫(yī)源性損傷的可行性與實(shí)用性，首先建立既符合臨床特征，又具有可操作性、可復(fù)制性的動物模型是先決條件。本實(shí)驗(yàn)則是為深入探討亞低溫預(yù)處理對脊髓內(nèi)手術(shù)保護(hù)方法及其機(jī)制而進(jìn)行的大鼠模型建立方法的研究。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 雄性SD大鼠108只(北京維通利華公司，合格證書:0097414)，體質(zhì)量(300±10)g，10周齡，適應(yīng)性飼養(yǎng)1W，自然光照，自由飲食，實(shí)驗(yàn)前12小時(shí)禁食，不禁水。將108只大鼠隨機(jī)分為3組:常溫下脊髓切開組(n=36)，亞低溫預(yù)處理脊髓切開組(n=36)，對照組(n=36)－硬脊膜外低溫鹽水灌注后不施行脊髓切開術(shù)。每組分 4h、8h、1d、3d、7d、14d 6個不同時(shí)間窗取材，進(jìn)行HE染色觀察病理變化。后者按照低溫預(yù)處理方法及溫度檢測進(jìn)行。

1.2 大鼠脊髓內(nèi)手術(shù)模型的復(fù)制 10% 的水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉后，俯臥固定，剪去背部被毛。無菌條件下背正中切口，顯露T11～13棘旁椎板，切除椎板顯露脊髓硬膜并切開。在手術(shù)顯微鏡下沿背正中溝切開脊髓長1cm，深1.5mm，放入1mm×2mm恒力撐開片，持續(xù)時(shí)間為1h后取出撐開片，關(guān)閉切口。術(shù)后肌注青霉素3d，10萬U/d，室溫保持在20～25℃，特殊護(hù)理飼養(yǎng)。

1.3 低溫預(yù)處理方法及溫度監(jiān)測 ①用縫線向上懸掛切口周邊皮膚，使之形成一小蓄水池。于硬脊膜外，采用4℃低溫生理鹽水通過輸液管從一端灌注，流量50ml/min，同時(shí)用吸引器在另一端向外引流。灌注時(shí)間為1h。②電子體溫計(jì)置于椎旁肌下，測溫度降至(33±1)℃。

1.4 標(biāo)本的采集及石蠟切片的制備 按照設(shè)計(jì)的時(shí)間窗宰殺大鼠，剖開胸腔顯露心臟，經(jīng)主動脈穿刺快速注入生理鹽水150～200mL，經(jīng)剪開右心耳放血，待流出血液變清亮后，快速注入4%多聚甲醛PBS固定液200mL，再以200mL相同固定液維持滴注1h后取材。以損傷部為中心取脊髓1cm，浸泡于同樣的固定液中，后固定過夜。然后常規(guī)脫水，固定、石蠟包埋，作冠狀面連續(xù)切片，切片厚度為5μm，HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.5軟件分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 低溫灌注前后直腸和脊髓溫度監(jiān)測結(jié)果 硬脊膜外低溫灌注1h后棘旁肌內(nèi)溫度明顯低于灌注前，直腸溫度也較灌注前有輕度下降，二者均同步下降5℃左右，見表1。

表1 亞低溫灌注前后直腸溫度與椎旁溫度比較(℃，)

表1 亞低溫灌注前后直腸溫度與椎旁溫度比較(℃，)

注:與低溫灌注后比較，△ P ＜0.01，*P ＜0.05

項(xiàng)目 例數(shù) 直腸溫度 椎旁溫度低溫灌注前 36 35.2±0.2△ 33.4±0.4*36 33.0 ±1.7 30.6 ±1.5低溫灌注后

2.2 病理組織學(xué)變化 對照組神經(jīng)細(xì)胞外形清晰，極性存在，核圓，核仁清楚，細(xì)胞核輪廓清晰光滑，軸丘清楚，組織無明顯水腫、出血和炎性細(xì)胞浸潤等表現(xiàn)。常溫組光鏡下可見4h脊髓后索、部分灰質(zhì)及側(cè)索出血，白質(zhì)水腫，神經(jīng)纖維紊亂，前后角的部分神經(jīng)元腫脹，極性消失。8h腫脹的神經(jīng)元增多，白質(zhì)腫脹加重，神經(jīng)纖維的髓鞘板層分離且散亂?；屹|(zhì)中出血灶可融合成片，神經(jīng)元可呈淡染、尼氏體消失、少數(shù)細(xì)胞崩解。神經(jīng)軸索腫脹，髓鞘進(jìn)一步分離散亂，有的破裂。1d白質(zhì)也呈片狀出血，在灰質(zhì)出血區(qū)可見灰質(zhì)破碎及壞死，有的形成小囊腔。神經(jīng)元明顯減少，見圖1。部分白質(zhì)開始破碎，神經(jīng)軸索濁腫，髓鞘破碎，

見圖2。3d脊髓液化及壞死面增大，白質(zhì)的近灰質(zhì)部分神經(jīng)軸索濁腫、破碎、髓鞘破碎，而周邊部分則變化較輕。7d脊髓中央部大部分壞死，殘存周邊部分白質(zhì)，其神經(jīng)軸索濁腫、退變、髓鞘碎裂。傷后14d，壞死區(qū)域有空洞形成，并可見大量膠質(zhì)細(xì)胞增生侵入，周邊部分白質(zhì)保存，部分軸索濁腫退變，崩解，出現(xiàn)微囊。低溫預(yù)處理組相應(yīng)的組織病理學(xué)損害出現(xiàn)的時(shí)間與常溫組基本相同，但病變的范圍較小，損害的程度也較輕，見圖3、4。

圖4 常溫組24h灰質(zhì)

圖5 常溫組24h白質(zhì)

圖6 低溫組24h灰質(zhì)

圖7 低溫組組24h白質(zhì)

3 討論

在生命科學(xué)領(lǐng)域中，實(shí)驗(yàn)研究是學(xué)科發(fā)展的基礎(chǔ)，尤其是動物實(shí)驗(yàn)，是生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中的重要組成部分。為了保證動物實(shí)驗(yàn)更科學(xué)、準(zhǔn)確和重復(fù)性好，本實(shí)驗(yàn)研究的動物模型是按特定需要設(shè)計(jì)、用大鼠模擬人體的一種模型，其復(fù)制符合最優(yōu)化的原則。

3.1 脊髓內(nèi)手術(shù)銳性切開+牽拉損傷動物模型的建立 目前SCI模型繁多，在 SCI模型中 Allen[4]的 WD 法經(jīng) Freeman Wright[5]、Ford[6]等改良，至今已成為比較成熟、完善、研究中最為廣泛的SCI模型。但是，模擬脊髓內(nèi)手術(shù)所致的銳性切開+牽拉性損傷的動物模型還未見有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)大鼠模型設(shè)計(jì)理論基礎(chǔ)為:①選擇T11～13段進(jìn)行操作，首先是因?yàn)樵撎幨羌怪淖罡唿c(diǎn)，手術(shù)操作方便，且能避開骶髓排便中樞便于術(shù)后管理;其次脊髓損傷節(jié)段越高，損傷后動物的死亡率亦越高，故選擇該三節(jié)段死亡率低。②T11～13段脊髓直徑只有3.1～3.5mm，制作模擬術(shù)中牽開器較為困難，選擇切開脊髓后放入厚度為0.8mm撐開片的方法可起到形同向兩側(cè)牽開脊髓組織的同樣作用，且對于兩側(cè)脊髓組織牽拉的力量恒定均等，故使用撐開片代替牽開器。③T11～13脊髓的長度分別為 4.5、4.3、4.0mm，寬度分別為3.1、3.3、3.5mm[7]。故將撐開片制作成長 6mm、寬 0.8mm、高1.5mm的塑料板，通過脊髓后正中切開長1cm、深1.5mm切口而放入。由此本模型既可模擬臨床髓內(nèi)手術(shù)切開+牽拉性損傷的致傷條件和受傷機(jī)制，又可保證部位固定、牽開力的恒定，具有高度的可復(fù)制性。

3.2 脊髓亞低溫的實(shí)施 脊髓的低溫實(shí)施有多種方法，大體可分為兩類:①系統(tǒng)低溫，即讓包括脊髓在內(nèi)的整個機(jī)體的溫度降低，以達(dá)到治療目的，有冰浴降溫、藥物降溫、血液降溫、傳導(dǎo)降溫、空氣對流降溫等方法。醫(yī)用自動降溫毯是一種較好的系統(tǒng)降溫工具，可控性好且具有降溫、復(fù)溫雙重功能，臨床上得到了較廣泛的應(yīng)用。②局部低溫，是用多種方法使脊髓等某一個或幾個器官溫度降低，而機(jī)體溫度保持不變或變化不明顯的治療方法。其應(yīng)用方法包括如局部低溫液體灌注、熱能交換器等。但之所以得出亞低溫治療SCI截然相反的結(jié)論，很可能是由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的一些不同處理方法造成的。包括:①實(shí)驗(yàn)動物品種的差異;②麻醉藥品及麻醉方法的不同;③脊髓損傷的方式不同;④其他藥物的選擇;⑤硬脊膜是否開放;⑥低溫技術(shù)的掌握及運(yùn)用存在差別;⑦低溫監(jiān)測的方法不同等。

本實(shí)驗(yàn)所采用脊髓內(nèi)切開+牽拉型SCI模型的主要病理改變系由于髓內(nèi)壓迫缺血所致，術(shù)后隨時(shí)間變化可發(fā)現(xiàn)常溫組大鼠脊髓會發(fā)生諸如出血、變性、壞死、液化以及膠質(zhì)瘢痕形成等病理形態(tài)學(xué)變化，高倍鏡下可見到細(xì)胞壞死、崩解、脊髓大面積空泡樣變等。在脊髓未切開前，施行硬脊膜外4℃生理鹽水緩慢灌注1h進(jìn)行預(yù)處理是安全而可行的，既不會對正常的脊髓組織形態(tài)造成損害，還可能具有預(yù)防或減輕髓內(nèi)手術(shù)后繼發(fā)性損傷的作用。

總之，本大鼠模型具有經(jīng)濟(jì)性、適用性、易行性、重復(fù)性、可靠性、穩(wěn)定性、可控性等特點(diǎn)，符合脊髓內(nèi)手術(shù)的臨床特征?？梢宰鳛樯钊胙芯縼喌蜏仡A(yù)處理對髓內(nèi)手術(shù)繼發(fā)性損傷的保護(hù)作用及其機(jī)理的動物模型。

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